張保柱，張愛(ài)眾，溫廣明

（晉中學(xué)院α.化學(xué)化工系；b.資產(chǎn)管理部，山西 晉中 030619）

三磷酸腺苷（ATP）作為一種重要的能量源，在細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)方面起到極其重要的作用，在絕大多數(shù)生物發(fā)生的各種類(lèi)型的生物化學(xué)反應(yīng)中扮演著能量提供者的角色［1］.ATP 的濃度和消耗速率能夠反映細(xì)胞的活性，而且與細(xì)胞的生存能力和損傷有一定的聯(lián)系.許多像帕金森癥、組織缺氧癥、低血糖癥、局部缺血癥和一些惡性腫瘤等疾病常與ATP含量的異常有關(guān)［1］.由于ATP 在臨床和生物學(xué)上的重要性，因此在生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、靈敏的ATP 檢測(cè)方法是至關(guān)重要的.

過(guò)去的幾十年，研究人員提出了各種各樣檢測(cè)ATP 的方法，像高效液相色譜法［2］、熒光法［3～7］、化學(xué)發(fā)光法［8］和比色法［9～10］.在這些檢測(cè)方法中，基于適配體的熒光傳感具有靈敏、特異、方便和儀器易于使用的優(yōu)點(diǎn)，受到研究者的高度關(guān)注［11～13］. 適配體是合成的單鏈DNA 或RNA，它是通過(guò)“SELEX”程序進(jìn)行人工選擇，它可以特異性地識(shí)別包括蛋白質(zhì)、金屬離子、小分子和細(xì)胞等各種各樣的靶標(biāo).

近年來(lái)，金屬納米簇越來(lái)越引起人們的關(guān)注，這是由于其獨(dú)特的性能以及被廣泛應(yīng)用到生物傳感、生物成像和光伏電池等領(lǐng)域.其中銀納米簇（簡(jiǎn)稱(chēng)Ag NCs）在溶液中比金納米簇發(fā)出更明亮的熒光，而且應(yīng)用更廣泛［14］.如果沒(méi)有模板或保護(hù)劑，Ag NCs 的壽命很短，容易聚集為納米顆粒，失去獨(dú)特的熒光性能［14］.有許多像硫醇、樹(shù)枝狀大分子、聚合物和DNA 寡合苷酸等物質(zhì)能用來(lái)保護(hù)Ag NCs［14］.其中用DNA 穩(wěn)定的Ag NCs 具有生物相容性好、毒性小、光穩(wěn)定好和熒光可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用［14］.

基于適配體和Ag NCs 的優(yōu)點(diǎn)，本研究設(shè)計(jì)了ATP 適配體和位于ATP 適配體兩端的Ag NCs 成核序列的DNA 模板，將此DNA 模板命名為BT5T5.在BT5T5 模板兩端的成核序列上合成Ag NCs，然后加入ATP，ATP 與其適配體特異性結(jié)合使適配體的構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致熒光較弱的Ag NCs 互相靠近熒光增強(qiáng)，ATP 便得到檢測(cè).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

BT5T5 寡合苷酸、ATP、CTP、GTP 和UTP 購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，胎牛血清蛋白購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，AgNO3、NaBH4購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，所有試劑均為分析純，未進(jìn)一步純化.磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液（簡(jiǎn)稱(chēng)PBS，20 mM，pH 7.0）在所有實(shí)驗(yàn)中使用.所有溶液用Milli-Q 水（18.2 M Ω cm）配置.

BT5T5 寡合苷酸的序列：

注：斜體字部分為Ag NCs 成核序列；粗體字部分為ATP 適配體；下劃線部分為連結(jié)序列.

FS5 穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀（英國(guó)利文斯頓愛(ài)丁堡儀器公司）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BT5T5-Ag NCs 的合成

本實(shí)驗(yàn)中，BT5T5-Ag NCs 的合成方法是按照以前文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行并做了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整［15］.將DNA（3 μM）和AgNO3（18 μM）分別加入PBS（20 mM，pH 7.0）溶液中，混勻后放在冰箱的冷藏中，在4 ℃下避光孵育20 min，緊接著把新配置的NaBH4（18 μM）加入上述溶液，搖勻后同樣置于冰箱的冷藏中，避光孵育1 h.BT5T5-Ag NCs 合成完成.

1.2.2 ATP 的檢測(cè)

將不同濃度的ATP（0～24 mM）加入BT5T5-Ag NCs 溶液中，孵育5 min 后在室溫下測(cè)定其熒光光譜.對(duì)于ATP 的選擇性，實(shí)驗(yàn)方法與檢測(cè)ATP 相同，只不過(guò)是用CTP、GTP 和UTP 代替了ATP.

1.2.3 BT5T5-Ag NCs 探針的實(shí)際應(yīng)用

用ATP 傳感器檢測(cè)稀釋胎牛血清中的ATP.把不同濃度的ATP 標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液用檢測(cè)ATP 的方法來(lái)檢測(cè).

2 結(jié)果與討論

2.1 BT5T5-Ag NCs 的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)

BT5T5-Ag NCs 的最佳激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)ATP靈敏性的檢測(cè)有一定的影響［15］.BT5T5-Ag NCs 的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)用FS5-穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光儀來(lái)測(cè)定.具體方法是用一定數(shù)值的激發(fā)波長(zhǎng)來(lái)測(cè)定其發(fā)射波長(zhǎng)，然后固定發(fā)射波長(zhǎng)來(lái)掃激發(fā)，掃出的激發(fā)和發(fā)射的圖形要基本對(duì)稱(chēng)且強(qiáng)度相等.如圖1 所示，曲線a 和b 分別為BT5T5-Ag NCs 的激發(fā)和發(fā)射光譜，其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為550 nm 和620 nm.

圖1 BT5T5-Ag NCs 的激發(fā)（曲線a）和發(fā)射（曲線b）光譜

2.2 ATP 與BT5T5-Ag NCs 熒光探針的作用時(shí)間

對(duì)ATP 與BT5T5-Ag NCs 熒光探針的作用時(shí)間進(jìn)行測(cè)定.如圖2 所示，BT5T5-Ag NCs 的熒光強(qiáng)度隨著作用時(shí)間的增加逐漸增強(qiáng)，5 min 時(shí)達(dá)到平臺(tái)，在0.5 h 內(nèi)熒光強(qiáng)度幾乎不變.因此5 min 作為ATP 最佳檢測(cè)時(shí)間.

圖2 BT5T5-Ag NCs 熒光強(qiáng)度隨ATP 與BT5T5-Ag NCs 作用時(shí)間的變化關(guān)系圖

2.3 BT5T5-Ag NCs 熒光探針的穩(wěn)定性

對(duì)BT5T5-Ag NCs 的穩(wěn)定性進(jìn)行研究. 如圖3所示：180 min 之前，BT5T5-Ag NCs 熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；180 min 時(shí)，熒光強(qiáng)度增加到最大，之后熒光強(qiáng)度緩慢下降. 因此對(duì)于后續(xù)實(shí)驗(yàn)是在制備Ag NCs 加入NaBH4后3 h 左右進(jìn)行.

圖3 BT5T5-Ag NCs(λex=550 nm)的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化

2.4 ATP 的檢測(cè)

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)ATP 做定量檢測(cè).將0～24 mM ATP 加到BT5T5-Ag NCs 溶液中，測(cè)得相應(yīng)的熒光光譜.如圖4A 和B，圖4A 為加入不同濃度的ATP時(shí)BT5T5-Ag NCs 的熒光光譜圖，圖4B 為BT5T5-Ag NCs 的熒光強(qiáng)度隨ATP 濃度的變化關(guān)系圖，插圖為其線性關(guān)系圖.在6～21 mM（R=0.968 7，線性方程為F=-112 717.7+57 731.1CATP）范圍內(nèi)BT5T5-Ag NCs 的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，ATP 的檢測(cè)限為16 μM（由空白樣標(biāo)準(zhǔn)偏差的3 倍除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計(jì)算所得）.該檢測(cè)限低于以前所報(bào)道的0.44 mM 和0.65 mM［16，17］，因此該熒光探針是高度靈敏的.

圖4 加入不同濃度的ATP（0-24 mM）BT5T5-Ag NCs 的熒光光譜圖

2.5 BT5T5-Ag NCs 熒光探針的選擇性

選擇性是評(píng)價(jià)熒光探針性能的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)［15］. 為了評(píng)估使用BT5T5-Ag NCs 檢測(cè)ATP 的擬議策略的特異性，研究了ATP 和其他類(lèi)似物，包括CTP、UTP 和GTP.如圖5 顯示，只有ATP 導(dǎo)致F/F0顯著增加，而CTP、UTP 和GTP 增加不明顯.該結(jié)果清楚地顯示BT5T5-Ag NCs 熒光探針對(duì)ATP 的選擇性好.

圖5 ATP 的特異性（F0 和F 分別是未加和加入ATP、CTP、UTP 和GTP 的熒光強(qiáng)度.

2.6 實(shí)際樣品中ATP 的檢測(cè)

為了評(píng)價(jià)BT5T5-Ag NCs 探針在實(shí)際樣品中的應(yīng)用和精確性，把3、6、9、12 mM 的ATP 分別加入稀釋了的胎牛血清溶液中并且用該探針測(cè)定.回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差列于表1 中，回收率的范圍為98.4 %～106.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的范圍為0.96 %～4.04%，該結(jié)果表明探針的精確率非常高.測(cè)量所得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差與報(bào)道的數(shù)值相當(dāng)［18～19］.上述結(jié)果證明該探針檢測(cè)實(shí)際樣品中的ATP 是可靠的.

表1 用該探針測(cè)量胎牛血清溶液中的ATP（N=3）

3 結(jié)論

總之，本研究基于BT5T5-Ag NCs，設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)ATP 熒光增強(qiáng)的熒光探針. ATP 與其適配體結(jié)合使得適配體構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致適配體兩端熒光較弱的Ag NCs 互相靠近，熒光增強(qiáng).該探針費(fèi)用低，毒性小，操作簡(jiǎn)單，靈敏性高，選擇性好.在0～24 mM 范圍內(nèi)ATP 的檢測(cè)限為16 μM.而且，該探針成功地檢測(cè)了胎牛血清中的ATP.因此該探針對(duì)生物樣品中ATP 的檢測(cè)具有廣闊的應(yīng)用前景.