鄭同慶

（山西堡子酒業(yè)有限公司生產(chǎn)部，山西 晉中 030600）

釀酒大曲含有物種豐富的微生物菌群，在釀酒過(guò)程中作為微生物發(fā)酵劑使用［1］.這種微生物菌群可將釀酒原料分解成白酒中的前體風(fēng)味物質(zhì)，它們的結(jié)構(gòu)和數(shù)量直接決定著酒體的風(fēng)格和產(chǎn)品質(zhì)量［2］.對(duì)釀酒大曲中微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，是了解釀酒過(guò)程中微生物作用的重要方法［3］［4］.分析釀酒大曲中優(yōu)勢(shì)菌群及其功能關(guān)系，對(duì)于釀造工藝的改進(jìn)和產(chǎn)品質(zhì)量的提升具有重要的意義［5］.在微生物研究的早期，多采用分離培養(yǎng)法進(jìn)行研究，這種方法所受限制頗多，得到的結(jié)果容易受多種因素影響，且操作繁瑣，所用時(shí)間較長(zhǎng)，獲得的可培養(yǎng)微生物種類不足樣品中的1%，無(wú)法對(duì)其進(jìn)行微生物結(jié)構(gòu)的解析［6］.近年來(lái)，基于DNA 分子標(biāo)記技術(shù)在微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究中得到了迅速的發(fā)展，特別是高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)與廣泛應(yīng)用，使其成為微生物研究領(lǐng)域的主要分析工具.高通量測(cè)序相比傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)突出，對(duì)于樣品中復(fù)雜的微生物菌群可輕松、實(shí)時(shí)、快速地進(jìn)行測(cè)序讀取，測(cè)序結(jié)果更準(zhǔn)確、更全面［7］.

關(guān)于酒曲的研究國(guó)內(nèi)多集中于研究酒曲中微生物組成結(jié)構(gòu)、酒曲理化性質(zhì)及對(duì)酒曲中功能菌群的分析.施安輝等對(duì)山東梁山徐坊大曲進(jìn)行研究，得出大曲中細(xì)菌、酵母、霉菌在全部培養(yǎng)微生物中所占比重和優(yōu)勢(shì)菌種類存在差異［8］. 徐瑾等較不同理化條件下，得出樣品細(xì)菌群落PCR-DGGE 最優(yōu)分析條件，研究了樣品菌群構(gòu)成的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律［9］.雷震河對(duì)大曲和酒醅中的微生物構(gòu)成進(jìn)行研究，得出大曲中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門包括厚壁細(xì)菌門、變形菌門等，優(yōu)勢(shì)真菌包括曲霉菌屬、熱子囊菌屬、根霉菌屬等［10］.曹苗文等對(duì)清香型白酒中功能型曲的應(yīng)用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在釀造過(guò)程中加入功能性曲，酒體中物質(zhì)成分發(fā)生極大改變［11］.目前在清香型大曲研究中，對(duì)釀造工藝的研究較多，而對(duì)清香大曲菌群結(jié)構(gòu)解析鮮有報(bào)道，采用高通量測(cè)序全面解析清香大曲細(xì)菌和真菌多樣性的研究未見(jiàn)報(bào)道.

本文以山西榆次堡子酒（清香型白酒）大曲為研究對(duì)象，對(duì)大曲中真菌、細(xì)菌的總DNA 進(jìn)行了提取，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，全面解析大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)，并對(duì)微生物功能基因進(jìn)行預(yù)測(cè). 本研究對(duì)全面了解堡子酒大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)傳統(tǒng)白酒釀造改造升級(jí)具有廣泛的應(yīng)用前景.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究中的實(shí)驗(yàn)材料（清香型堡子酒釀酒大曲）采自山西堡子酒業(yè)有限公司.

取樣方法：取酒廠粉碎后貯存期為7 天的堡子酒大曲，隨機(jī)抽取酒曲袋，取袋中上部、中部、下部酒曲混合，編號(hào)為DQ.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取及高通量測(cè)序

取采集到的樣品釀酒大曲10 g，迅速密封于無(wú)菌袋中，-20 ℃保存?zhèn)溆?

對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理后，使用E.Z.N.ATM Mag-Bind DNA Kit（OMEGA）試劑盒進(jìn)行基因組DNA 的提取. 對(duì)得到的樣品DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增所用引物見(jiàn)表1.對(duì)經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)文庫(kù)大小，檢測(cè)合格后的擴(kuò)增產(chǎn)物送到測(cè)序公司（上海生工）進(jìn)行高通量測(cè)序.

表1 16S PCR 與ITS PCR 引物

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采 用R 3.6.0、Fasttree 2.1.7、Python 2.7.3、PICRUSt 1.1.4、FUNGuild 1.0 等軟件，對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行處理與分析.本文使用RDP 16S 數(shù)據(jù)庫(kù)、Unite 數(shù)據(jù)庫(kù)等.

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)序結(jié)果預(yù)處理

數(shù)據(jù)預(yù)處理：首先需將得到的雙端測(cè)序數(shù)據(jù)拼接成一條完整的序列，并對(duì)所有樣品的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，以獲得有效標(biāo)簽.主要包括以下步驟：去除引物接頭，進(jìn)行拼接、過(guò)濾，得到高質(zhì)量的序列數(shù)據(jù).

表2 為樣品測(cè)序的雙端序列經(jīng)過(guò)拼接得到的原始序列信息和經(jīng)過(guò)濾后的序列信息.對(duì)比可以看出，樣品原始序列經(jīng)過(guò)濾后，有效序列數(shù)得到降低；最短序列長(zhǎng)度和最長(zhǎng)序列長(zhǎng)度發(fā)生變化，說(shuō)明異常長(zhǎng)度的序列被去除；同時(shí)平均序列長(zhǎng)度發(fā)生改變，過(guò)濾后的平均序列長(zhǎng)度與測(cè)序目的片段的長(zhǎng)度范圍更接近，提高了后續(xù)處理結(jié)果的準(zhǔn)確性.

表2 樣品序列數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計(jì)

2.2 樣品測(cè)序結(jié)果分析

2.2.1 OTU 統(tǒng)計(jì)

將質(zhì)控后的序列以97%的相似度閾值聚類為操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU），獲得OTUs 序列數(shù)信息. 樣本16S 測(cè)序獲得的OTUs 序列數(shù)為57 402 條，ITS 測(cè)序獲得的OTUs 序列數(shù)為70 631 條；對(duì)16S 測(cè)序結(jié)果進(jìn)行聚類得到126 個(gè)OTUs，對(duì)ITS 測(cè)序結(jié)果進(jìn)行聚類得到48 個(gè)OTUs.

2.2.2 微生物物種注釋及分類學(xué)分析

使用QIIME 和SILVA 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTUs 的代表性序列進(jìn)行物種注釋和分析，以獲得各分類水平上的類群信息（由于16S 和ITS 的高通量測(cè)序?qū)τ谟H緣關(guān)系較近的種分辨率不高，部分微生物在種水平未被分辨出，故種水平的物種信息未列出）.通過(guò)統(tǒng)計(jì)大曲樣品的群落組成，得出細(xì)菌類群共獲得了11 門、20 綱、33 目、71 科、103 屬；真菌類群共獲得了5 門、11 綱、21 目、35 科、54 屬.無(wú)論在哪個(gè)分類水平，得到的細(xì)菌數(shù)量均多于真菌，表明細(xì)菌在各水平的數(shù)量分布均高于真菌，大曲中細(xì)菌菌群的多樣性高于真菌菌群.

2.3 微生物群落多樣性分析

2.3.1 Alpha 多樣性指數(shù)分析

通過(guò)評(píng)估Alpha 多樣性指數(shù)，可以表征微生物群落的多樣性、豐富度和均勻程度.在97%相似度水平下，樣品Alpha 多樣性指數(shù)值如表3 所示.依據(jù)表3 對(duì)樣品的幾種指標(biāo)進(jìn)行分析對(duì)比，來(lái)分析樣品的復(fù)雜程度.與真菌相比，大曲中細(xì)菌的ACE、Chao 和Shannon 指數(shù)均較高，且Simpson 指數(shù)較低，表明細(xì)菌類群中物種的數(shù)量較多，細(xì)菌菌群豐富度大于真菌菌群，提示細(xì)菌可能在釀酒過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用；樣品中細(xì)菌和真菌的Coverage 值均在0.99 以上，說(shuō)明樣本中序列被測(cè)出的概率較高，樣本文庫(kù)的覆蓋率較高，反映出本次測(cè)序結(jié)果能夠代表樣品中菌群的真實(shí)情況.

表3 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.3.2 稀釋性曲線特征分析

采用對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表的OTU 數(shù)目構(gòu)建稀疏性曲線.圖1 為所構(gòu)建的持續(xù)抽樣下新OTUs 出現(xiàn)的稀疏性曲線：起初，曲線隨測(cè)序條數(shù)的增多而急劇升高，表明樣品中出現(xiàn)了大量的物種；隨后稀疏性曲線趨于平坦，則表示測(cè)序數(shù)據(jù)接近飽和，說(shuō)明所取樣品量足以覆蓋所有細(xì)菌和真菌；且圖1（a）曲線平緩后的高度較圖1（b）高，進(jìn)一步說(shuō)明樣品中細(xì)菌豐富度較真菌高.

圖1 樣品稀釋曲線

2.4 物種組成分析

2.4.1 門水平物種組成分析

對(duì)樣本在門水平進(jìn)行物種多樣性組成分析可知，大曲樣本細(xì)菌在門水平主要有五大門類：變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria_Chloroplast）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）. 清香型白酒大曲中細(xì)菌在門水平上還存在所占一定比例的未分類菌群和其他菌群（占比小于1 %）. 其中變形菌門占43.8%、厚壁菌門占37.3 %和藍(lán)細(xì)菌門占13.5%為細(xì)菌門類的優(yōu)勢(shì)菌群.清香型白酒大曲真菌在門水平主要有三大門類：子囊菌門（Ascomycota）、毛霉菌門（Mucoromycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）. 其中子囊菌門在真菌中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，占總豐度的99.1%.與真菌群落相比，堡子酒大曲中的細(xì)菌在門類水平上的菌群數(shù)量更為豐富，且各細(xì)菌門之間的相對(duì)豐度比例相差較小；而真菌群落中的各門類所占比重相差較大，主要以子囊菌門占主導(dǎo).對(duì)比張雙燕［12］關(guān)于清香型大曲微生物組成的研究，樣品大曲中菌群種類組成與其所用大曲相似，但各個(gè)菌群所占比重存在差異.

2.4.2 屬水平物種組成分析

對(duì)樣本在屬水平進(jìn)行物種多樣性組成分析可知，清香型白酒大曲細(xì)菌在屬水平的菌群分布主要包括：泛菌屬（Pantoea）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、鏈霉菌屬（Streptophyta）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、片球菌屬（Pediococcus）、短桿菌屬（Brevibacterium）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、根瘤菌屬（Rhizobium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、黃桿菌屬（Chryseobacterium）、鹽單胞菌屬（Halomonas）等，未分類的菌群和其他菌群豐度占總菌群的17.7%.其中泛菌屬、乳酸桿菌屬、鏈霉菌屬為細(xì)菌屬水平的優(yōu)勢(shì)菌屬，分別占35.4%、17.5%和13.5%；乳酸菌能夠產(chǎn)生乳酸等白酒風(fēng)味的前體物質(zhì)和影響發(fā)酵環(huán)境，作為優(yōu)勢(shì)菌群具有重要作用，其在大曲中的含量決定著大曲的質(zhì)量［13］.乳酸可減少酒體刺激、延長(zhǎng)白酒后味，在清香型白酒入口綿柔中得到體現(xiàn)，但乳酸含量過(guò)多會(huì)使口感酸澀，嚴(yán)重影響白酒風(fēng)味［14］［15］.

清香型白酒大曲真菌在屬水平的菌群分布：有孢圓酵母屬（Torulaspora）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、畢赤酵母（Pichia）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）、根霉屬（Rhizopus）、雙足囊菌屬（Dipodascus）、曲霉（Aspergillus）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、念珠菌（Candida）、酵母菌（Saccharomyces）、絲孢酵母屬（Trichosporon）等，其他菌群豐度占總菌群的0.7 %.真菌在屬水平不存在未得到分類注釋的菌群.其中孢圓酵母屬、伊薩酵母屬、畢赤酵母為真菌屬水平的優(yōu)勢(shì)菌屬，分別占52.6%、33.5%和9.7%，孢圓酵母屬在真菌菌群屬水平占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì).從真菌屬水平菌群結(jié)構(gòu)上看，大多菌屬為酵母菌、根霉和曲霉等，其中酵母菌發(fā)酵能力較強(qiáng)，根霉和曲霉系主要糖化菌，可為釀造過(guò)程提供發(fā)酵動(dòng)力［16］［17］，這些真菌在提高高粱的利用率和白酒出酒率方面具有重要的作用.

2.5 微生物功能基因預(yù)測(cè)分析

2.5.1 細(xì)菌功能基因預(yù)測(cè)

PICRUSt 是一種利用16S rDNA 預(yù)測(cè)功能基因組成及含量的生物信息學(xué)工具，其能夠更好地分析樣本的功能信息. 在COG（Clusters of Orthologous Groups，直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)）功能數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，得出預(yù)測(cè)結(jié)果.

從樣品細(xì)菌中注釋到了4 167 個(gè)COG，如表4，這些COG 存在23 個(gè)功能類別中.其中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝、轉(zhuǎn)錄、一般功能預(yù)測(cè)在樣品中均高表達(dá)，而RNA 的加工與修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)、真核細(xì)胞的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)、核外結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架的表達(dá)則相對(duì)較低.細(xì)菌中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝的高表達(dá)，究其原因可能與清香型堡子酒大曲制作工藝有關(guān)，堡子酒大曲以大麥、豌豆等為主要原料，釀造過(guò)程中需微生物進(jìn)行發(fā)酵分解［18］［19］.

表4 COG 二級(jí)分類功能預(yù)測(cè)結(jié)果

2.5.2 真菌功能基因預(yù)測(cè)

采用FUNGuild 預(yù)測(cè)清香型白酒大曲樣品真菌群落的營(yíng)養(yǎng)型和功能群，預(yù)測(cè)結(jié)果如表5.樣品大曲被鑒定出三種營(yíng)養(yǎng)型，分別為病理營(yíng)養(yǎng)型（Pathotroph）、腐生營(yíng)養(yǎng)型（Saprotroph）以及共生營(yíng)養(yǎng)型（Symbiotroph），占比分別為34.2%、17.7%、14.3%，其余為FUNGuild 暫不可鑒別的功能群. 從營(yíng)養(yǎng)型來(lái)說(shuō)，樣品中真菌以病理營(yíng)養(yǎng)型為主，占比顯著高于腐生營(yíng)養(yǎng)型和共生營(yíng)養(yǎng)型，反映出清香型白酒大曲有利于病理營(yíng)養(yǎng)型真菌的生長(zhǎng).樣品大曲共有6 個(gè)功能群從真菌中鑒定出來(lái)，分別為動(dòng)物病原 菌（Animal Pathogen）、 植 物 病 原 菌（Plant Pathogen）、未定義腐生真菌（Undefined Saprotroph）、土壤腐生真菌（Soil Saprotroph）、動(dòng)物內(nèi)生真菌（Animal Endosymbiont）、內(nèi)生真菌Endophyte），其中動(dòng)物病原菌和未定義腐生真菌在樣本大曲中活性較高.樣品中未被鑒別出的真菌占比38.3%，可見(jiàn)清香型白酒大曲真菌的功能存在一定的復(fù)雜性，對(duì)此部分真菌仍待深入研究.

表5 真菌功能分類

3 結(jié)論

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析了清香型白酒大曲微生物的菌群特征，闡明了樣品大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)，并對(duì)微生物進(jìn)行了功能基因預(yù)測(cè).通過(guò)測(cè)序?qū)Υ笄鷺悠愤M(jìn)行分析，得出大曲中細(xì)菌和真菌在各水平的菌群分布情況存在差異性，細(xì)菌豐富度和均勻程度較真菌高；對(duì)樣品進(jìn)行物種組成分析，得出在門水平細(xì)菌中變形菌門、厚壁菌門和藍(lán)細(xì)菌門為細(xì)菌門類的優(yōu)勢(shì)菌群，占比為43.8 %、37.7%、13.5%.

真菌中子囊菌門為門水平絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，占比為99.1%.在屬水平中泛菌屬、乳酸桿菌屬、鏈霉菌屬為細(xì)菌屬水平的優(yōu)勢(shì)菌屬，占比35.4%、17.5%和13.5%.孢圓酵母屬在真菌菌群屬水平占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，占比為52.6%.對(duì)樣品進(jìn)行功能基因預(yù)測(cè)分析，得出細(xì)菌中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝、轉(zhuǎn)錄、一般功能預(yù)測(cè)表達(dá)水平高；真菌被鑒定出三種營(yíng)養(yǎng)型和六個(gè)功能群.