楊海涵，胥世洪，李 軍，房春林

(1.成都乾坤動物藥業(yè)股份有限公司，四川 成都 610000；2.四川省獸藥監(jiān)察所，四川 成都 610000；3.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院，四川 成都 610000)

0 引言

VA、VD3、VE常作為添加劑用于畜禽飼料中，特別是預混合維生素飼料中，三者同時添加的概率比較大[1-3]。在現(xiàn)行的預混合維生素飼料檢測方法中，3種維生素分別進行直接提取后檢測，三者流動相均為甲醇:水(98:2)，檢測波長分別為326 nm、264 nm、285 nm，流速等其他條件差異不大[4-6]。在檢測時發(fā)現(xiàn)，VA、VD3、VE均能出現(xiàn)分離度合格的色譜峰，因此，試驗對VA、VD3、VE同時測定展開研究[7]。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent-1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；島津SPD-M20A、LC-15C、LC-20A高效液相色譜儀，島津(中國)有限公司；BP211D型分析天平，中國(北京)賽多利斯有限公司；UV-1800PC紫外-可見光分光光度計，上海美諾達儀器有限公司。

VA醋酸酯對照品，中國藥品食品檢定研究院，含量98%，批號100368-201502；VD3對照品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量98%，批號F1813051；D-α-生育酚對照品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量97%，批號H1815030。

維生素預混合飼料“多維營養(yǎng)素”，VA、VD3、VE均為水溶性包合物，成都欣牧生物科技有限公司，批號為20200408。

1.2 方法

1.2.1 波長選擇

分別精密稱取VA、VD3、VE對照品適量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，使分別含VA、VD3、VE約1 mg/mL，于200～400 nm掃描，確定3種維生素均有吸收的波長范圍。根據(jù)紫外掃描結果，分別對VA、VD3、VE混合液進行檢測，流動相為甲醇:水(98:2)，柱溫30℃，流速1 mL/min。記錄色譜圖，分析主峰的峰面積大小、分離度、理論板塔數(shù)及對稱性，從而選擇最優(yōu)的檢測波長。

1.2.2 繪制標準曲線

精密配置含VA 0.173 0 mg/mL、VD30.161 7 mg/mL、VE 2.111 6 mg/mL的混合溶液，倍比稀釋6次。將以上7種溶液分別注入液相色譜儀檢測，記錄峰面積，并以峰面積對濃度作圖，分別得到3個維生素的線型回歸方程，r2應不小于0.999 9。

1.2.3 條件穩(wěn)定性評估

按照獸藥典的規(guī)定，對建立方法的精密度、重復性、回收率進行檢測，應符合規(guī)定。

1.2.4 樣品檢測及實用性試驗

取預混合維生素添加劑樣品，分別用Agilent-1260高效液相色譜儀(紫外檢測器，SB-C18色譜柱)、島津SPD-M20A高效液相色譜儀(光電二極管陣列紫外檢測器，島津OSD-2色譜柱)、島津LC-15C高效液相色譜儀(紫外檢測器，依利特OSD-2色譜柱)、島津LC-2010-AHT高效液相色譜儀(紫外檢測器，島津OSD-2色譜柱)進行檢測，計算樣品含量并進行分析，各種設備檢測結果差異應不顯著。

1.2.5 與原方法比較

取預混合維生素添加劑樣品，分別用VA、VD3、VE單獨檢測方法進行檢測，檢測結果與該次實驗結果進行比較，差異應不顯著。

2 結果

2.1 色譜條件選擇

將VA、VD3、VE的混合溶液置于紫外-可見風光光度計掃描，發(fā)現(xiàn)279～290 nm VA、VD3、VE的吸收值相對平衡。通過高效液相色譜間隔3 nm波長進行檢測發(fā)現(xiàn)，當波長為288 nm時，VA、VD3、VE 3個主峰的峰面積、分離度、理論板塔數(shù)及峰的對稱性等均優(yōu)于其他波長。調整流動相中甲醇濃度，并檢測3種維生素在30 min內(nèi)的圖譜，當甲醇濃度為98%、100%時，3種維生素均在30 min內(nèi)出峰，但峰的分離度98%優(yōu)于100%，因此，以甲醇:水(98:2)作為流動相。

2.2 繪制標準曲線

將含有VA、VD3、VE的混合標準品溶液，倍比稀釋后。分別注入液相色譜儀測定峰面積并記錄，并用測得峰面積對濃度作圖得標準曲線方程。

VA:y=14 113x+22.271，R2=0.999 9，線性范圍:0.002 7～0.173 0 mg/mL。

VD3:y=0 056x+7.535 6，R2=0.999 9，線性范圍:0.002 5～0.161 7 mg/mL。

VE:y=10 217x+132.78，R2=0.999 9，線性范圍:0.033 0～2.111 6 mg/mL。

2.3 精密試驗

取標準品混合液，重復進樣6次，記錄峰面積并分析，得出3種維生素的變異系數(shù)均(R)小于2.0%，分別為1.30%、0.52%、0.47%，說明本系統(tǒng)精密度良好，具體如表1所示。

表1 精密度試驗

2.4 重復性試驗

精密稱取預混合維生素飼料樣品6份，加甲醇稀釋后，將6種溶液分別精密量取10 μL濾過后注入液相色譜儀檢測，記錄峰面積并分析，發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)(R)均<2.0%，分別為0.46%、1.30%、0.28%(見表2)。

表2 重復性試驗

2.5 回收率試驗

按照重復性試驗項下處理樣品溶液，分別加入對照品使溶解。搖勻后稀釋至刻度，濾過后注入液相色譜儀檢測，記錄峰面積計算溶液濃度，并計算對照品的平均回收率分別為100.10%、99.20%、97.92%(均>95%)[7]，變異系數(shù)(R)均<2.0%，分別為0.96%、0.86%、1.23%，說明該方法回收率良好，重復性高，如表3所示。

表3 3種維生素回收率試驗

2.6 適用性試驗

取重復性試驗項下稀釋樣品(5 g→100 mL)，分別用4種不同液相色譜儀進行檢測，外標法計算含量并進行分析，結果得出各組數(shù)據(jù)差異不顯著(p<0.05)，說明該方法可以同時測定預混合飼料添加中VA、VD3、VE的含量，且適用性較好，如表4所示。

表4 適用性試驗 單位：mg/mL

2.7 與原方法比較

取重復性試驗項下稀釋樣品(5 g→100 mL)，分別用VA、VD3、VE單獨檢測方法進行檢測，與該實驗方法及實驗結果進行比較，差異不顯著(t<0.05)，具體如表5所示。

表5 與原方法比較 單位：mg/mL

3 結論

綜上所述，該方法可用于預混合維生素飼料中VA、VD3、VE的含量測定。線性關系、精密度、重復性及回收率均比較良好，因此，此法可以用于實際生產(chǎn)中，其具體參數(shù)為流動相甲醇:水(98:2)，波長288 nm、柱溫30℃，流速1.0 mL/min。另外，該次試驗用甲醇:水(98:2)為流動相，檢測范圍分別為2.7～173.0 μg/mL，2.5～161.7 μg/mL，33.0～2 111.6 μg/mL，與文獻比較，VA和VE的檢測限度較低，流動相相對簡單[8-9]。

該次試驗中，對樣品的處理仍然采用原標準中的處理方法，即精密稱定樣品，加入適量甲醇，60℃超聲處理1 h，冷卻后加甲醇至刻度。原標準中需要調整3次波長，按標準進樣方法需要進樣9次，甲醇的消耗量比較大，且所需時間較長，該次試驗將甲醇的消耗和所需時間均降低至原來的1/3，因此，優(yōu)于3種維生素的單獨測定。但是，該次試驗只針對能直接提取VA、VD3、VE的預混合維生素飼料樣品檢測，對于動物或植物體內(nèi)需要進行轉化后或者成分復雜樣本的VA、VD3、VE的檢測，需要進一步研究。