吳佳莉，徐國(guó)婧，韋笑笑，于艷君，王少杰，任雯麗，崔文，蘇瀟男

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067

硅藻檢驗(yàn)技術(shù)是溺死診斷、溺水地點(diǎn)推斷等法醫(yī)學(xué)實(shí)踐最常用的檢測(cè)方法之一[1]。硅藻作為一種廣泛存在于水域中的單細(xì)胞藻類(lèi)，對(duì)環(huán)境十分敏感[2]，其分布具有明顯的區(qū)域性特征[2-4]。將死者器官中所檢硅藻藻屬與尸體發(fā)現(xiàn)地水域硅藻進(jìn)行對(duì)比，可對(duì)溺水地點(diǎn)的判斷提供參考。法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已開(kāi)始致力于建立部分重要水域的硅藻數(shù)據(jù)庫(kù)以便在實(shí)踐中進(jìn)行查找對(duì)比[5]，如北京[6]、蘇州[7]的城中水域、珠江流域廣東段[8]、長(zhǎng)江和嘉陵江重慶主城區(qū)段[9]等。京杭大運(yùn)河通航段（山東濟(jì)寧—江蘇常州）全長(zhǎng)約900 km，年通過(guò)能力達(dá)9.5 億噸，從古至今都是京杭大運(yùn)河重要的航運(yùn)路線。京杭大運(yùn)河橫跨兩省，且經(jīng)過(guò)秦嶺-淮河一線，從上游到下游不論是氣候、降雨量，還是人文環(huán)境都具有巨大差異[10]。京杭大運(yùn)河作為世界上里程最長(zhǎng)、工程最大的古代運(yùn)河，在中國(guó)僅次于長(zhǎng)江的第二條“黃金水道”[11]，溺亡案件在此水域的發(fā)生率也極高，因此具有重大研究?jī)r(jià)值。本研究擬調(diào)查京杭大運(yùn)河通航段（浙江杭州通航量較少，未納入本次研究）的硅藻分布規(guī)律，建立該水域硅藻數(shù)據(jù)庫(kù)，為公安機(jī)關(guān)偵破案件提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

硝酸（65%～68%，分析純）、過(guò)氧化氫（30%，分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）、甲醛溶液（分析純）均購(gòu)自煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司。

BHW-09A16 消解儀（上海博通化學(xué)科技有限公司），HL-6 多聯(lián)真空抽濾儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司），DiatomScopeTMXL 系統(tǒng)[復(fù)納科學(xué)儀器（上海）有限公司]，有機(jī)濾膜（直徑25.00 mm，孔徑0.45 μm，廣州益典實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），Multiwave PRO 微波消解系統(tǒng)（奧地利Anton Paar 公司），SBC-12 型離子濺射儀（北京中科科儀股份有限公司）。

1.2 采樣點(diǎn)

在京杭大運(yùn)河通航段（濟(jì)寧段—常州段）進(jìn)行實(shí)地勘驗(yàn)，隨機(jī)確定22個(gè)采樣點(diǎn)，于2021年4月進(jìn)行水樣采集，每個(gè)采樣點(diǎn)采集1次。采樣點(diǎn)具體位置見(jiàn)表1。采樣點(diǎn)E、G 附近為微山湖，采樣點(diǎn)K 附近為船閘口，采樣點(diǎn)L 附近為碼頭。采樣點(diǎn)A～Q 屬于溫帶季風(fēng)氣候，采樣點(diǎn)R～V 屬于亞熱帶氣候。

表1 各采樣點(diǎn)情況Tab.1 Information of each sampling sites

1.3 水樣的采集及保存

在各采樣點(diǎn)，于運(yùn)河水面中央水下0.5 m 處取500 mL 水樣。水樣帶回后用5 層醫(yī)用紗布進(jìn)行過(guò)濾除雜，更換新紗布后重復(fù)進(jìn)行3 次，接著加入25 mL 甲醛溶液于除雜后的濾液，使之固定并存放于陰涼處。

1.4 石墨消解-掃描電子顯微鏡法

1.4.1 硅藻檢驗(yàn)

取5 mL 水樣置于消解管中，加入6 mL 硝酸。在BHW-09A16 消解儀中以110 ℃加熱1 h，待冷卻至室溫22 ℃后，加入50 mL 純水稀釋。再采用HL-6 多聯(lián)真空抽濾儀進(jìn)行真空抽濾，將硅藻富集于半徑8 mm的圓形有機(jī)濾膜富集區(qū)上，以便最大程度地獲得硅藻數(shù)量、種類(lèi)的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。抽濾完畢后，加入50 mL 超純水，再加入5 mL 乙醇以加速濾膜干燥。將有機(jī)濾膜取下烘干，貼在樣品座上，SBC-12 型離子濺射儀進(jìn)行真空噴鍍金膜后，用DiatomScopeTMXL 系統(tǒng)分析。

1.4.2 硅藻圖像采集并觀察

采用抽樣調(diào)查方法，每個(gè)樣品隨機(jī)抽取25%的面積，利用DiatomScopeTMXL 系統(tǒng)（加速電壓2.00 kV）在1 500×下對(duì)直徑8 mm 的每個(gè)圓形樣品隨機(jī)抽取1 500 張圖像，并根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行人工計(jì)數(shù)，以采樣點(diǎn)所在省份分地區(qū)記錄硅藻數(shù)量、綱目、所屬種屬以及特征藻屬（指僅此采樣點(diǎn)擁有，而其他采樣點(diǎn)不存在的藻屬）。硅藻計(jì)數(shù)參考文獻(xiàn)[12]。

1.5 各類(lèi)指數(shù)分析

計(jì)算各采樣點(diǎn)硅藻含量（C）、硅藻構(gòu)成比（Ri）、物種優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（Y）、Shannon-Wiener 指數(shù)（H’）、Margalef 指數(shù)（dma）、Pielou 指數(shù)（J）、Simpson 指數(shù)（D），各采樣點(diǎn)硅藻含量、硅藻構(gòu)成比應(yīng)用SPSSAU v21.0（https://www.spssau.com，北京青絲科技有限公司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)物種均勻度（Pielou 指數(shù)）和物種多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener 指數(shù)）進(jìn)行t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。公式如下：

式中，C表示水樣中硅藻的含量，N表示觀察到的硅藻總數(shù)，V表示水樣體積。

式中，i表示某個(gè)硅藻種屬，Ri表示第i類(lèi)硅藻藻屬占比，ni表示i類(lèi)硅藻藻屬的硅藻數(shù)量，N表示觀察到的硅藻總數(shù)。

式中，ni表示第i類(lèi)硅藻的數(shù)量，N表示硅藻總數(shù)。fi表示樣品中某類(lèi)硅藻出現(xiàn)的頻率。當(dāng)Y＞0.02 即為優(yōu)勢(shì)藻屬。

式中，Pi=，Pi表明第i個(gè)種屬的相對(duì)多度，S表示群落中所有硅藻藻屬數(shù)量，i表示某個(gè)硅藻種屬，ni表示第i類(lèi)硅藻的數(shù)量，N表示觀察到的硅藻總數(shù)。Shannon-Wiener 指數(shù)基于物種數(shù)量反映群落種類(lèi)多樣性，群落中生物種類(lèi)增多代表群落的復(fù)雜程度增高，即H’值越大，群落所含的信息量越大。

式中，S表示群落中所有硅藻藻屬數(shù)量，N表示硅藻總數(shù)。Margalef 指數(shù)反映群落物種豐富度，指一個(gè)群落或環(huán)境中物種數(shù)目的多寡，亦表示生物樣品中種類(lèi)豐富度程度。

式中，Hmax=log2S，Hmax表示最大的物種多樣性指數(shù)，S表示群落中硅藻藻屬數(shù)量，H’表示Shannon-Wiener 指數(shù)，Pielou 指數(shù)代表硅藻群落中各種屬分布的相對(duì)集中度。

式中，Pi=，Pi表示第i類(lèi)藻屬的相對(duì)多度，S表示群落中所有硅藻藻屬數(shù)量，i表示硅藻種屬，ni表示第i類(lèi)硅藻的數(shù)量，N表示觀察到的硅藻總數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 硅藻數(shù)量

共檢出硅藻9 666個(gè)。整體看來(lái)，各采樣點(diǎn)硅藻種屬含量有所差異，硅藻數(shù)量最多的采樣點(diǎn)T（1 564 個(gè)）是數(shù)量最少采樣點(diǎn)O（23 個(gè)）的68 倍（表2）。

表2 各采樣點(diǎn)硅藻含量Tab.2 Diatom content at each sampling site

2.2 優(yōu)勢(shì)藻屬

共檢出24 種硅藻，分屬中心綱、羽紋綱兩綱（圖1），其中圓篩藻屬、冠盤(pán)藻屬、菱形藻屬分別占約16.02%、12.18%和11.30%，位列前三。溫帶季風(fēng)氣候地區(qū)的各采樣點(diǎn)（采樣點(diǎn)A～Q）檢出24 種5 578 個(gè)硅藻，優(yōu)勢(shì)藻屬為圓篩藻屬、針桿藻屬、舟形藻屬、卵形藻屬、冠盤(pán)藻屬、海鏈藻屬、小環(huán)藻屬、直鏈藻屬、等片藻屬、脆桿藻屬。亞熱帶氣候地區(qū)的各采樣點(diǎn)（采樣點(diǎn)R～V）檢出20 種4 088 個(gè)硅藻，優(yōu)勢(shì)藻屬為圓篩藻屬、冠盤(pán)藻屬、等片藻屬、菱形藻屬、舟形藻屬。采樣點(diǎn)Q 不同硅藻藻屬（19 種）最多，采樣點(diǎn)O 不同硅藻藻屬（7 種）最少（圖2）。

圖1 京杭大運(yùn)河通航段各采樣點(diǎn)主要藻屬構(gòu)成比Fig.1 Composition ratio of main diatoms at each sampling site in the navigation section of Beijing -Hangzhou Grand Canal

圖2 各采樣點(diǎn)硅藻藻屬數(shù)量Fig.2 Number of diatom species at each sampling site

各采樣點(diǎn)硅藻主要藻屬較為一致，采樣點(diǎn)A、B、I、J 均具有特征藻屬，分別為美壁藻屬、彎楔藻屬、雙眉藻屬、窗紋藻屬。

從物種優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（Y）發(fā)現(xiàn)，各采樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)藻屬以中心綱為主，部分采樣點(diǎn)為羽紋綱。

從表3 可見(jiàn)，采樣點(diǎn)J、Q 的物種優(yōu)勢(shì)度較大，藻屬少；采樣點(diǎn)N 的物種優(yōu)勢(shì)度較小，種類(lèi)多。

表3 各采樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)藻屬Tab.3 Dominance diatom species at each sampling site

2.3 各生物指數(shù)分布

Pielou 指數(shù)（J）、Simpson 指數(shù)（D）曲線相對(duì)平穩(wěn)，Shannon-Wiener 指數(shù)（H’）、Margalef 指數(shù)（dma）曲線有一定起伏（圖3），其中，船閘口、碼頭、微山湖附近采樣點(diǎn)（即采樣點(diǎn)E、G、K、L）的Shannon-Wiener 指數(shù)（H’）偏低。

圖3 各采樣點(diǎn)Pielou 指數(shù)（J）、Simpson 指數(shù)（D）、Shannon-Wiener指數(shù)（H’）、Margalef（dma）指數(shù)對(duì)比圖Fig.3 Comparing diagram of the Pielou（J），Simpson（D），Shannon-Wiener（H’）and Margalef（dma）indexes of each sampling site

3 討論

由于水體運(yùn)動(dòng)、人類(lèi)活動(dòng)等一系列因素，尸體發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)往往并非實(shí)際入水地點(diǎn)，因此，對(duì)于入水地點(diǎn)的判斷成為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐的重要環(huán)節(jié)。目前能作為溺死地點(diǎn)推斷標(biāo)志物的主要有異物顆粒、硅藻與其他浮游生物（如藍(lán)藻、綠藻等）三大類(lèi)[18]。在這三者中，硅藻檢驗(yàn)擁有較為穩(wěn)定且能廣泛應(yīng)用的特點(diǎn)，硅藻檢驗(yàn)技術(shù)從最早的化學(xué)消化法，再到酶消化法，到如今最高效的微波消解-真空抽濾-掃描電子顯微鏡法，呈現(xiàn)日漸成熟的趨勢(shì)。研究[19]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)建立區(qū)域性溺死多發(fā)河段硅藻數(shù)據(jù)庫(kù)，利用相似系數(shù)、差異系數(shù)及聚類(lèi)分析進(jìn)行落水地點(diǎn)推斷具有一定可行性。目前，在刑事案件偵查中，法醫(yī)通過(guò)對(duì)溺液中硅藻藻屬和數(shù)量的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，判斷其與實(shí)地水樣是否一致，已有將硅藻檢驗(yàn)用于推斷溺亡位置的實(shí)際應(yīng)用案例[20]，南京市公安局在某一河道中發(fā)現(xiàn)1 具未知名女童尸體，初步確定漂流范圍后，法醫(yī)工作者選取5 個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行水樣采集，計(jì)算死者肺組織中優(yōu)勢(shì)硅藻群落與5 處水樣中硅藻群落的Sprensen 相似系數(shù)和平方弦距離，分析硅藻種屬構(gòu)成的相似性，最終排除尸體漂流的可能，推斷落水地點(diǎn)即為發(fā)現(xiàn)尸體現(xiàn)場(chǎng)附近。

人在溺水過(guò)程中必然會(huì)掙扎并吸入大量河水進(jìn)入消化道和呼吸道，進(jìn)入呼吸道內(nèi)的溺液最具研究?jī)r(jià)值[21]?；诠柙鍖?duì)環(huán)境的敏感性，本研究結(jié)果顯示，各采樣點(diǎn)之間優(yōu)勢(shì)藻屬不盡相同，且優(yōu)勢(shì)度也具有一定差異。由于山東省、江蘇省所處地理位置特殊，恰巧處于淮河一線兩邊，而秦嶺-淮河一線正是我國(guó)南北方地理分界線，兩省一南一北，具有鮮明的地理特性，具有研究?jī)r(jià)值。結(jié)合前期研究結(jié)果[12]，本研究結(jié)果再次印證硅藻在物種豐富度上可能呈由北向南逐漸增加的趨勢(shì)。部分采樣點(diǎn)有特征藻屬，如采樣點(diǎn)A、B、I、J 的特征藻屬分別為美壁藻屬、彎楔藻屬、雙眉藻屬、窗紋藻屬。在檢驗(yàn)中，特征藻屬能使檢驗(yàn)人員快速識(shí)別水樣來(lái)源河段，從而判斷尸體發(fā)現(xiàn)地是否為死亡地點(diǎn)。

本研究通過(guò)Shannon-Wiener 指數(shù)（H’）分析發(fā)現(xiàn)，位于船閘口、碼頭、微山湖這類(lèi)環(huán)境復(fù)雜、人流量大的地區(qū)的采樣點(diǎn)（如采樣點(diǎn)E、G、K、L）硅藻藻屬可能比較豐富，物種多樣性可能較高。過(guò)于頻繁的人類(lèi)活動(dòng)對(duì)水體環(huán)境產(chǎn)生影響，影響水體中硅藻分布，引起數(shù)量和種屬的差異。此外，京杭大運(yùn)河作為我國(guó)南水北調(diào)工程?hào)|線的主要輸水渠道，途徑江蘇省、山東省多地。山東省濟(jì)寧市、棗莊市屬于溫帶季風(fēng)氣候。在江蘇省淮安市淮河蘇北灌溉總渠以北的徐州市、宿遷市均為溫帶季風(fēng)氣候，其以南的揚(yáng)州市為亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候向溫帶季風(fēng)氣候的過(guò)渡區(qū)、鎮(zhèn)江市為亞熱帶季風(fēng)氣候，常州市為亞熱帶海洋性氣候。本研究通過(guò)物種優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（Y），確定各采樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)藻屬，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，屬于溫帶季風(fēng)氣候地區(qū)的各采樣點(diǎn)（采樣點(diǎn)A～Q）硅藻優(yōu)勢(shì)藻屬以中心綱為主，羽紋綱優(yōu)勢(shì)藻屬較少；而屬于亞熱帶氣候地區(qū)的各采樣點(diǎn)（采樣點(diǎn)R～V）硅藻優(yōu)勢(shì)藻屬均無(wú)中心綱，大多具有共同優(yōu)勢(shì)藻屬——菱形藻屬。即在不同氣候帶，硅藻分布具有一定藻屬差異，后續(xù)可以進(jìn)行深入研究，有助于跨省或者地理位置跨度大的溺水案件的偵查。

本研究由于采樣點(diǎn)較少、取樣時(shí)間單一，可能與實(shí)際數(shù)據(jù)存在一定偏差，后期將增加采樣點(diǎn)和采樣時(shí)間的多樣性，以完善相關(guān)數(shù)據(jù)。