賴文昶 黃森豪 祁成民 吳仁燁

摘 ? ?要：水稻是我國主要糧食作物之一，水稻育種是一項(xiàng)重要的科研工作。隨著科技的發(fā)展，相關(guān)人員研發(fā)出越來越多的新型生物技術(shù)，例如基因工程、細(xì)胞工程、分子標(biāo)記技術(shù)、基因編輯技術(shù)等，并在水稻育種研究中得到廣泛的應(yīng)用，解決了育種工作中出現(xiàn)的許多問題。文章論述了生物技術(shù)在水稻育種中的作用，總結(jié)了生物技術(shù)在水稻育種中存在的問題，以供參考。

關(guān)鍵詞：水稻育種;生物技術(shù);基因工程;細(xì)胞工程;分子標(biāo)記技術(shù);基因編輯技術(shù)

文章編號：1005-2690（2022）09-0034-03 ? ? ? 中國圖書分類號：S511 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

水稻是稻屬谷類作物，是世界上最主要的三大糧食作物之一，種植面積占世界糧食總面積的1/5。我國是世界上最大的水稻生產(chǎn)國和消費(fèi)國，水稻產(chǎn)量約占全國糧食總產(chǎn)量的1/2。同時(shí)，水稻在釀酒、醫(yī)藥、工業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，水稻事業(yè)的發(fā)展與國家糧食安全關(guān)系重大。

生物技術(shù)以基因工程和細(xì)胞工程為核心，包含發(fā)酵工程、酶工程等生物技術(shù)的新興學(xué)科。目前，我國水稻育種面臨病蟲害頻發(fā)、人多地少、選育效率低等問題，生物技術(shù)可以有效解決這些問題，被廣泛應(yīng)用于水稻育種中。

1 基因工程

基因工程也被稱作基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是在分子生物學(xué)和微生物學(xué)的基礎(chǔ)上，以分子遺傳學(xué)為理論來源的現(xiàn)代生物技術(shù)。水稻基因工程育種是把需要的目的基因克隆轉(zhuǎn)移到水稻上，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對水稻遺傳特性的改良。同時(shí)，通過建立完善高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，對優(yōu)良的目的基因進(jìn)行整合和表達(dá)，使之穩(wěn)定地遺傳給下一代[1]。在基因轉(zhuǎn)化過程中常被使用的外植物體包括愈傷組織、原生質(zhì)體和根尖、莖尖等組織器官，水稻的幼穗、幼胚和花藥等愈傷細(xì)胞往往作為基因轉(zhuǎn)化的受體。

目前，水稻轉(zhuǎn)基因包括抗病性基因、抗蟲性基因、抗除草劑基因、抗逆性基因以及品質(zhì)改良基因等。促進(jìn)水稻基因工程育種的發(fā)展對于培育高產(chǎn)、抗病、抗蟲、抗逆的新型水稻品種，對推動農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1.1 基因槍法

基因槍法是利用高壓放電、壓縮氣體等方法產(chǎn)生的巨大動力，使黏有目標(biāo)DNA的高速金（鎢）微粒轟擊進(jìn)入靶細(xì)胞，再通過未知機(jī)制，將外源DNA導(dǎo)入植物染色體上實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)。

基因槍法的可控度較高，可根據(jù)需要將金屬顆粒射入特定的細(xì)胞，并且不受宿主的限制。但基因槍轟擊位點(diǎn)的隨機(jī)性和整合位點(diǎn)的不固定性，大大增加了基因突變、丟失和基因沉默的可能性，影響了外源基因在生物體內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。

1.2 花粉管通道法

花粉管通道法也被稱為授粉后外源基因?qū)胫参锛夹g(shù)。在植物完成授粉后，柱頭部位的花粉會形成一個(gè)花粉管通道，然后采用人工方法將外源DNA轉(zhuǎn)移至胚囊。由于受精卵和生殖細(xì)胞仍處于未形成細(xì)胞壁的“原生質(zhì)體”狀態(tài)，外源DNA片段容易進(jìn)入、整合到原有的基因組中，達(dá)到遺傳轉(zhuǎn)化的目的。

當(dāng)前流行的方法包括花粉管直接攜帶法、花粉勻漿涂抹柱頭法、自花授粉后導(dǎo)入法、受體花粉及供體DNA混合授粉法等。

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌是在土壤中普遍存在的一種革蘭氏陰性菌，能夠在自然條件下有選擇地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，產(chǎn)生根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌。具體過程是將根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中的一段T-DNA插入到植物基因組中，進(jìn)而對水稻的性狀進(jìn)行改良[2]。

1.3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻的優(yōu)點(diǎn)

與基因槍法、花粉管通道法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是最經(jīng)濟(jì)、操作最為簡單的方法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法利用天然的載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，具有高效率、高成功率的特點(diǎn)。外源DNA有明顯的轉(zhuǎn)化機(jī)理，能夠在轉(zhuǎn)化過程中保持穩(wěn)定。外源基因在植物器官內(nèi)進(jìn)行特異性表達(dá)，可進(jìn)行人為控制。

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入的外源DNA結(jié)構(gòu)完整，反應(yīng)機(jī)理清楚，整合位點(diǎn)穩(wěn)定。經(jīng)過Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的外源大多以單拷貝為主，且符合孟德爾遺傳定律。因此通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的植物大多被應(yīng)用于育種的中間選育材料。T-DNA含有能夠被植物體識別的功能啟動子和轉(zhuǎn)錄信號，能夠使外源DNA和T-DNA一同在植物體內(nèi)表達(dá)[3]。

1.3.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻的缺點(diǎn)

存在再生細(xì)胞感受態(tài)與轉(zhuǎn)化細(xì)胞感受態(tài)不一致的情況。農(nóng)桿菌可能會使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。農(nóng)桿菌介導(dǎo)目前僅在雙子葉植物中被廣泛應(yīng)用，對于單子葉植物的轉(zhuǎn)化仍比較困難。

2 細(xì)胞工程

2.1 細(xì)胞工程育種簡述

細(xì)胞工程的主要理論支撐和思想來源是Haberlandt在20世紀(jì)初提出的植物細(xì)胞全能性，是指植物體的每個(gè)體細(xì)胞都攜帶一整套完整的植物基因組，在理論上具備發(fā)育成一個(gè)完整植株的能力。

在細(xì)胞水平上對植物細(xì)胞進(jìn)行融合，再通過細(xì)胞核質(zhì)移植、染色體移植等操作，培育植物新品種、改善植物性狀或引入新性狀。當(dāng)前流行的細(xì)胞工程技術(shù)主要有無性系篩選、原生質(zhì)體培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交、花藥培養(yǎng)和多倍體育種等。

植物學(xué)家曾運(yùn)用細(xì)胞工程技術(shù)雜交兩種植物的體細(xì)胞創(chuàng)造出一個(gè)新細(xì)胞，對其進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，讓先分裂分化為組織，進(jìn)而發(fā)芽生根，最后發(fā)育成新植物，新植物同時(shí)具有親代的各自特征，而且在外觀上很像親代植物的組合體。

更有生物學(xué)家幻想將動物細(xì)胞與植物細(xì)胞相融合，讓動物具有植物的葉綠體，使其具有光合作用，能夠自己合成營養(yǎng)物質(zhì)。除此之外，還有許多基于細(xì)胞工程得以實(shí)現(xiàn)的成果，目前細(xì)胞工程的許多技術(shù)已十分成熟，且廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。

2.2 細(xì)胞工程育種的特點(diǎn)

細(xì)胞工程育種可以改良舊植物品種或產(chǎn)生新植物品種，篩選出良好性狀的植物品種，改善植物的生長速度、繁殖速度，實(shí)現(xiàn)種子脫毒。運(yùn)用細(xì)胞工程技術(shù)改良的植物可以穩(wěn)定遺傳性狀，加快育種進(jìn)程，提高育種效率，縮短育種年限。體細(xì)胞融合技術(shù)和雜交技術(shù)等新技術(shù)的出現(xiàn)，可以幫助相關(guān)人員克服植物間遠(yuǎn)緣雜交不親和的問題。

2.3 細(xì)胞工程技術(shù)在水稻育種中的應(yīng)用

早在20世紀(jì)70年代，我國便開始將細(xì)胞工程技術(shù)運(yùn)用于水稻育種。先是中國科學(xué)院嘗試將水稻花粉離體培養(yǎng)，不久中科院遺傳所率先使用單倍體育種法先后培育出兩個(gè)新品種水稻，在之后的50多年里，我國育種專家不斷將各種細(xì)胞工程技術(shù)運(yùn)用到水稻育種中，如今許多技術(shù)已相當(dāng)成熟并實(shí)現(xiàn)了廣泛應(yīng)用[4]。例如，水稻的花藥培養(yǎng)技術(shù)不僅應(yīng)用于常規(guī)育種與雜交育種，而且在水稻“恢復(fù)系”和“不恢復(fù)系”材料的選育方面也發(fā)揮了重要作用。

3 分子標(biāo)記技術(shù)

3.1 分子標(biāo)記技術(shù)的簡介及原理

DNA分子標(biāo)記技術(shù)是一種依靠基因組DNA中核苷酸排列順序的差異示位、追蹤、顯示不同個(gè)體之間所潛藏的遺傳變異差異的生物技術(shù)[5]。分子標(biāo)記最早出現(xiàn)要追溯到20世紀(jì)80～90年代SSR技術(shù)（Simple Sequence Repeat：簡單重復(fù)序列）和RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism：限制性片段長度多態(tài)性）的橫空出世。

前者是依靠當(dāng)時(shí)已經(jīng)成熟的PCR技術(shù)（Polymerase Chain Reaction）和微衛(wèi)星DNA特性的標(biāo)記技術(shù)，原理是在真核生物基因組上會出現(xiàn)短串聯(lián)重復(fù)序列這一序列，又稱微衛(wèi)星DNA，不同個(gè)體之間的重復(fù)序列長度不同，根據(jù)這一差異可以在微衛(wèi)星序列的兩端設(shè)計(jì)引物，再通過PCR技術(shù)對微衛(wèi)星序列進(jìn)行大量擴(kuò)增。因?yàn)椴煌瑐€(gè)體間的序列長度不同，所以使用PCR技術(shù)擴(kuò)增出的序列長度也有所不同，因此電泳出的條帶大小也不同。

RFLP技術(shù)比SSR技術(shù)更早，早在1974年Grodzicke等人就創(chuàng)立了RFLP技術(shù)，其建立在DNA雜交技術(shù)原理的基礎(chǔ)上，同時(shí)也是最早廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù)。分子標(biāo)記技術(shù)首先使用特定的限制性內(nèi)切酶對整個(gè)基因組進(jìn)行切割，得到長度不同的DNA片段，再通過southern雜交和放射性影像顯示得到相應(yīng)的圖譜，不同圖譜能反映出不同個(gè)體間酶切位點(diǎn)的多態(tài)性。RFLP技術(shù)因?yàn)槠涔诧@性與特定位點(diǎn)的多樣性，在遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳育種、臨床醫(yī)療診斷等許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

3.2 分子標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn)

分子標(biāo)記技術(shù)相對于其他標(biāo)記技術(shù)來說優(yōu)點(diǎn)突出，分子標(biāo)記技術(shù)受環(huán)境影響較小、穩(wěn)定性較高、準(zhǔn)確性高、多態(tài)性強(qiáng)。分子標(biāo)記技術(shù)以基因突變?yōu)榛A(chǔ)，分子標(biāo)記的數(shù)量眾多且分布較廣，從理論的角度出發(fā)，標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無限的，生物發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，不同器官、不同組織的DNA都可以用作于分子標(biāo)記分析。

大多數(shù)DNA分子標(biāo)記具有共顯性，利用這一特點(diǎn)能夠鑒定和識別雜合子與純合子的基因型。分子標(biāo)記的表現(xiàn)為中性，對表達(dá)目標(biāo)性狀的影響幾乎為零，并且與不良性狀不存在任何連鎖關(guān)系，最重要的是操作簡單、檢驗(yàn)迅速。

3.3 分子標(biāo)記技術(shù)在水稻遺傳育種中的應(yīng)用

通過分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行基因定位、基因型鑒定、目的基因篩選、基因克隆等操作都是育種過程中所需要的，分子標(biāo)記技術(shù)不僅提高了準(zhǔn)確性及選擇效率，還縮短了育種周期與育種年限，具有很強(qiáng)的目的性，在水稻的遺傳育種中應(yīng)用非常廣泛。

分子標(biāo)記技術(shù)在水稻的抗病蟲育種中同樣發(fā)揮了重要作用，在抗病基因的選擇上得益于分子標(biāo)記技術(shù)輔助，準(zhǔn)確率和精確率得以大大提高。尤其在抗稻瘟病的研究中發(fā)揮了非常重要的作用。

我國科學(xué)家鄭祥正等發(fā)明了一種名叫InDel的標(biāo)記，該標(biāo)記能夠準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)抗病基因和非抗病基因的基因分型，大大簡化了水稻抗稻瘟病種質(zhì)的篩選工作[6]。陳紅旗等通過分子標(biāo)記技術(shù)在保持系金23B中導(dǎo)入基因Pi-1，Pi-3（抗稻瘟病基因），使其達(dá)到了96.7%的抗病率[7]。

分子標(biāo)記技術(shù)還可以幫助構(gòu)建水稻的分子遺傳圖譜，以分子標(biāo)記技術(shù)為工具，通過目的基因分子標(biāo)記之間的緊密連鎖實(shí)現(xiàn)目的基因的定位，構(gòu)建出水稻的高密度的遺傳連鎖圖譜。1988年McCouh率先構(gòu)建了第一張水稻遺傳圖譜，Causse等和Harushima等緊隨其后分別完成了不同標(biāo)記數(shù)量的高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建工作，在之后的30多年間標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)目不斷增加，已經(jīng)達(dá)到326個(gè)RFLP標(biāo)記，公布的水稻SSR標(biāo)記達(dá)到14 000多個(gè)，基本實(shí)現(xiàn)了基因組的全部覆蓋。

4 基因編輯技術(shù)

4.1 基因編輯技術(shù)的簡介及特點(diǎn)

基因編輯也被稱作基因組編輯（genome editing）或基因組工程（genome engineering），是一種能夠準(zhǔn)確修飾生物體特定目標(biāo)基因的新興技術(shù)。基因編輯技術(shù)是利用去除或添加基因、替代基因、定點(diǎn)突變等方式修飾原有的基因，改變物種原有的基因型，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)物種性狀的改變。目前，比較流行的基因編輯技術(shù)包括一代ZFNs基因編輯技術(shù)、二代TALENs基因編輯技術(shù)和三代CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)[8]。

4.2 基因編輯技術(shù)在水稻育種中的應(yīng)用

目前，大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，基因編輯技術(shù)與水稻育種速率和效率密切相關(guān)。利用CRISPR/Cas9技術(shù)培育的水稻具有較高的出苗率。覃玉芬等通過CRISPR/Cas9技術(shù)系統(tǒng)編輯水稻品種GXU41中TMS5的兩個(gè)靶點(diǎn)位，獲得純合突變的T0代陽性植株，并在T1代獲得到無外源標(biāo)記的植株。表明該技術(shù)能夠提高得到TGMS系效率。

隨著生活水平的提高，人們對水稻的口感和香糯程度也有了更高的要求，基因編輯技術(shù)恰恰使這一目標(biāo)成為現(xiàn)實(shí)?，F(xiàn)階段，可使用基因編輯技術(shù)改良人們所需的水稻性狀，從而將水稻中直鏈淀粉的含量達(dá)到最適水平[9]。

5 生物技術(shù)在水稻育種中存在的問題與展望

雖然當(dāng)前生物技術(shù)在水稻育種中得以廣泛應(yīng)用，取得了較大進(jìn)展，但仍存在一些現(xiàn)實(shí)性問題亟待解決。我國缺乏高效完整的基因發(fā)掘技術(shù)，對于實(shí)用分子的標(biāo)記仍處于空白，一些重要的目標(biāo)性狀基因急需標(biāo)記。水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)仍處于發(fā)展階段，水稻的出愈率、綠芽分化率較低，后期可能會影響后代的基因型表達(dá)。應(yīng)用生物技術(shù)培育的水稻雖然實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)性狀的轉(zhuǎn)移，但要想應(yīng)用于生產(chǎn)必須通過常規(guī)育種進(jìn)行加工。農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)無法同時(shí)標(biāo)記多個(gè)目標(biāo)性狀，農(nóng)藝產(chǎn)品無法滿足市場對品種的需求[10]。

因此，要加快水稻基因工程與細(xì)胞工程的結(jié)合，充分利用我國豐富的水稻種質(zhì)資源，建立優(yōu)良的水稻核心種質(zhì)資源基因庫，利用分子標(biāo)記技術(shù)對不同的種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性評價(jià)，構(gòu)建以農(nóng)家稻、野生稻、恢復(fù)系、不育系為核心的種質(zhì)，為我國水稻發(fā)展提供源源不斷的種質(zhì)資源。將生物技術(shù)和常規(guī)育種相結(jié)合，使用回交方法將導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)入生產(chǎn)品種中，或通過常規(guī)品種和轉(zhuǎn)基因品種的雜交，利用系譜法選出新品種。

只要抓住生物技術(shù)發(fā)展的契機(jī)，充分做足理論、技術(shù)的準(zhǔn)備，就能利用生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)水稻優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、廣適應(yīng)性改良的目標(biāo)，更好地緩解糧食供給側(cè)結(jié)構(gòu)矛盾，促進(jìn)我國水稻產(chǎn)業(yè)增效提質(zhì)。

參考文獻(xiàn)：

[1]張文銀，楊生明.水稻基因工程育種現(xiàn)狀及其展望[J].寧夏農(nóng)林科技，2008（6）：105-106.

[2]秦潔.生物技術(shù)在玉米育種中的應(yīng)用研究[J].農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備，2021（5）：50-51.

[3]潘素君，戴良英，劉雄倫，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在水稻基因工程中的應(yīng)用[J].中國稻米，2007（3）：10-14.

[4]程式華.中國水稻育種百年發(fā)展與展望[J].中國稻米，2021，27（4）：1-6.

[5]高美鳳，王曉峰，夏蓮紅，等.3種水稻分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的應(yīng)用概況[J].上海農(nóng)業(yè)科技，2017（5）：49-51.

[6]張金霞，劉賀梅，孫建權(quán)，等.分子標(biāo)記技術(shù)在水稻品種改良中的應(yīng)用[J].中國種業(yè)，2021（9）：14-18.

[7]戴揚(yáng)，熊懷陽，黃劍.分子標(biāo)記技術(shù)在水稻育種中的應(yīng)用分析[J].農(nóng)業(yè)開發(fā)與裝備，2020（11）：54-55.

[8]李萌，姜恭好，段海燕.基因編輯技術(shù)在水稻遺傳改良中的應(yīng)用進(jìn)展[J].南方農(nóng)業(yè)，2021，15（34）：7-11，19.

[9]覃玉芬，廖山岳，郭新穎，等.利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制新型水稻溫敏雄性核不育系[J/OL].[2022-02-19].http//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210402.1611.016.html.

[10]張文銀，安永平，王彩芬，等.水稻生物技術(shù)育種現(xiàn)狀及其展望[J].種子，2008（11）：60-63.