姜佳寧 王 琪 王若雨 高金琦 陳雯婷 王 剛
大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤科,遼寧大連 116001
惡性腫瘤的發(fā)病率、死亡率逐年呈穩(wěn)定上漲趨勢,發(fā)病年齡則出現(xiàn)年輕化趨勢[1]。隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制探討、新藥研發(fā)、診療手段的不斷規(guī)范化、精準(zhǔn)化,患者的診斷率、治療有效率都有了明顯的提升。然而,惡性腫瘤細(xì)胞通常具備高侵襲能力,一旦出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移,將大大提高患者的死亡風(fēng)險[2]。雖現(xiàn)有技術(shù)已明顯提高了腫瘤患者的檢出率,但對于精準(zhǔn)診療、評估預(yù)后、評價療效等方面存在很多不足之處,仍有很大一部分患者就診時已處于晚期,失去最佳治療機(jī)會。提高惡性腫瘤患者的早期檢出率是解決問題的關(guān)鍵。隨著循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTC)的出現(xiàn)及不斷深入研究,CTC 分選作為一種“液態(tài)病理活檢”技術(shù),可協(xié)助臨床診斷明確、轉(zhuǎn)移評估、預(yù)后判斷、療效評價及精準(zhǔn)個體化醫(yī)療的指導(dǎo)[3-4]。美國強(qiáng)生公司開發(fā)的CellSearch System 是唯一被食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn),用于臨床乳腺癌、肺腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌患者的CTC檢測。但該裝置因檢測成本高、操作復(fù)雜、體積笨重等不足,尚未廣泛應(yīng)用于臨床患者CTC檢測。因此,如何實現(xiàn)臨床CTC 快速、方便、準(zhǔn)確的檢測一直是研究的熱點(diǎn)。微流控芯片技術(shù)具備微型化、自動化、集成化和便攜化等優(yōu)勢,彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測方法的不足,在生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)、物理研究等方面均有所應(yīng)用[5]。因此,利用微流控芯片的優(yōu)勢,構(gòu)建集成化的CTC 分選裝置,克服了CellSearch System的不足,具備成本低、無創(chuàng)、簡單、可重復(fù)、順應(yīng)性好等優(yōu)勢,并可獲得高達(dá)90%以上的檢測率,更適合于臨床患者CTC的檢測[6]。本研究將應(yīng)用該檢測裝置對55 例臨床腫瘤患者外周血標(biāo)本CTC 分選,分析CTC 分選結(jié)果與患者臨床病理特征,包括發(fā)病年齡、性別、腫瘤分化程度、分期、類別、腫瘤轉(zhuǎn)移及療效評價的相關(guān)性。以期進(jìn)一步實現(xiàn)該裝置的臨床普及應(yīng)用,為提高腫瘤患者的診斷及治療提供更好的方法。
1.1.1 儀器 倒置熒光顯微鏡、光刻機(jī)、甩膠機(jī)、等離子去膠機(jī)、超凈工作臺、二氧化碳水套式培養(yǎng)箱、LS100CO2 激光雕刻機(jī)、OB1 pressure controller、熱壓機(jī)、低溫高速離心機(jī)。
1.1.2 試劑 芯片制備試劑:PDMS、固化劑、CD45 磁珠、紅細(xì)胞裂解液。免疫親和反應(yīng)試劑:鼠尾膠原蛋白、EpCAM 抗體、CD45 抗體、panCytokerin 抗體。
1.1.3 研究對象 本研究納入2017 年1 月至2018 年12 月在大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院確診的惡性腫瘤患者共55 例,每例患者抽取外周靜脈血4 ml。其中男25 例,女30 例;年齡42~82歲,平均(61.02 ±19.14)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):初治經(jīng)病理證實的惡性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn):①存在肝腎功能異常及心、腦、精神系統(tǒng)等疾病等。②臨床資料不完整。本項研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意批準(zhǔn)(批號:2017071)。參與的患者或家屬均知情同意,并簽署知情同意書。
1.2.1 基于微流控芯片的CTC 分選裝置構(gòu)建 本研究利用微流控芯片技術(shù)平臺,構(gòu)建了集成化的CTC 分選平臺。該平臺由DLD 芯片、磁場負(fù)性純化芯片及鼠尾膠原蛋白捕獲組成。DLD 芯片的設(shè)計是依據(jù)CTC的物理學(xué)特性,其尺寸為15~20 μm,明顯大于紅細(xì)胞、血小板及95%以上白細(xì)胞。磁場負(fù)性純化平臺是依據(jù)白細(xì)胞表面特異性表達(dá)CD45 抗體,因此經(jīng)DLD分選后的樣本經(jīng)過CD45 磁珠充分作用后,在磁場負(fù)性分離作用下將白細(xì)胞進(jìn)一步去除。最后,CTC 與極少量的白細(xì)胞通過正性分選免疫親和反應(yīng)被捕獲,CTC 表達(dá)為EPCAM+/CK+/CD45-,白細(xì)胞表達(dá)為EPCAM-/CK-/CD45+,整體示意圖見圖1[6]。
1.2.2 標(biāo)本采集 應(yīng)用EDTA 抗凝管留取患者初治前、治療后的外周靜脈血標(biāo)本各4 ml,室溫保存,6 h 內(nèi)完成檢測。
1.2.3 臨床腫瘤患者外周血CTC 分選 應(yīng)用既往設(shè)計的微流控芯片裝置分選CTC,記錄每例患者外周血的CTC 情況,分析檢測結(jié)果與患者發(fā)病年齡、性別、腫瘤診斷、臨床分期、分化程度等臨床資料的相關(guān)性。
分析患者CTC 分選結(jié)果與患者性別、年齡、診斷、分期、癌腫不同及腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。同時,對于接受抗腫瘤治療的患者,觀察治療前后CTC 數(shù)目的變化與臨床影像學(xué)(CT、彩超、核磁等)評效的一致性。
采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用百分率表示,組間比較采用χ2檢驗;療效評價分析采用Kappa 一致性檢驗。其中Kappa≥0.75 為兩者一致性較好;0.75>Kappa≥0.4 為兩者一致性一般;Kappa<0.4 為兩者一致性較差。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
55 例惡性腫瘤患者中CTC 陽性例數(shù)為29 例,檢出率為52.73%,共檢出178個CTC。檢出率與腫瘤分化及腫瘤TNM 分期有關(guān)(P <0.05),與發(fā)病年齡、性別及不同腫瘤類別無關(guān)(P >0.05)。見表1。
表1 55 例患者一般臨床病理特征及基線CTC 計數(shù)分析
上述55 例患者中,29 例檢測結(jié)果為陽性,其中28 例臨床已證實有明確的轉(zhuǎn)移灶,即CTC檢出率為陽性的患者中,96.6%的患者存在轉(zhuǎn)移。對于檢測結(jié)果為陰性的26 例患者中,18 例存在轉(zhuǎn)移。檢出率與腫瘤轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(χ2=5.613,P <0.05)。
在55 例患者中,剔除去首診后拒絕行抗腫瘤治療的患者及早期未檢測到CTC 后續(xù)復(fù)查仍檢測結(jié)果為陰性的患者,共39 例患者納入進(jìn)一步分析。于治療(化療、放療、分子靶向治療、內(nèi)分泌治療)前后分別檢測外周血中CTC 數(shù)目,同時行胸腹部CT 等相關(guān)檢查,根據(jù)RECIEST 評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評效。在39 例患者中,26 例患者治療后復(fù)查CTC 數(shù)目上升,經(jīng)臨床檢查:血清腫瘤標(biāo)志物及影像學(xué),包括CT、MRI、全身骨顯象、超聲等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中8 例患者病情復(fù)發(fā),16 例患者病情進(jìn)展,療效評價為進(jìn)展,2 例患者病情穩(wěn)定,療效評價穩(wěn)定。對于CTC檢測結(jié)果不變或下降的13 例患者,其中9 例患者為治療后復(fù)查未見腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移征象。4 例患者為行下周期化療入院,臨床療效評價部分緩解或穩(wěn)定。通過Kappa 一致性檢驗分析,結(jié)果提示CTC檢測情況與RECIEST 標(biāo)準(zhǔn)評價效果存在良好的一致性(Kappa=0.889,P <0.001)。見表2。
表2 CTC 變化與影像療效評價關(guān)系統(tǒng)計表
惡性腫瘤通常分化程度差、惡性程度高,早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移,一旦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,患者預(yù)后極差,生存期嚴(yán)重縮短,死亡率大幅度提高[7]?,F(xiàn)有的腫瘤檢查技術(shù)手段對明確診斷、判斷預(yù)后及指導(dǎo)治療存在一定的局限,主要有影像學(xué)、血清腫瘤標(biāo)志物、組織病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢查等。影像學(xué)檢查雖能直觀地評價腫瘤的大小和侵及范圍,但靈敏度低,對微小病灶檢出率低。血清腫瘤標(biāo)志物檢測可用于輔助診斷、監(jiān)測腫瘤進(jìn)展和復(fù)發(fā),但是目前尚缺少特異的腫瘤標(biāo)志物,假陽性率和假陰性率較高。病理學(xué)診斷是腫瘤診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但通過手術(shù)或穿刺方法獲得活檢樣本的方法對患者的創(chuàng)傷較大。另外,取材受限常導(dǎo)致無法實現(xiàn)對腫瘤實時動態(tài)的監(jiān)測。CTC 與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),CTC 分選有助于預(yù)測及明確腫瘤轉(zhuǎn)移,并反映腫瘤特征,為腫瘤診治提供依據(jù),也可作為靶向治療的靶標(biāo)指導(dǎo)治療方案的制訂[8]。且采集外周血具備創(chuàng)傷小、順應(yīng)性好、操作方便及可重復(fù)等優(yōu)勢,有望克服臨床腫瘤診療的難題。
現(xiàn)有的CTC 分選原理主要依據(jù)兩方面,基于物理學(xué)特性[9-11]及生物學(xué)特性進(jìn)行分選[12-16]。本研究構(gòu)建的基于微流控芯片的集成化的CTC 分選裝置,融合了二者優(yōu)勢,克服了各自的不足。首先,基于CTC的尺寸遠(yuǎn)大于正常外周血細(xì)胞(紅細(xì)胞、血小板及大部分白細(xì)胞)的物理學(xué)特性,構(gòu)建了CTC 初步快速的分選芯片—DLD 芯片,在1 ml/min的通量下實現(xiàn)CTC 初步快速的分選,通過該芯片可使95%以上的白細(xì)胞、全部紅細(xì)胞、血小板被去除。隨后,依據(jù)白細(xì)胞表面特異性表達(dá)CD45,構(gòu)建自動化的磁性負(fù)性純化裝置,進(jìn)一步去除殘余白細(xì)胞90%以上。最后,利用CTC的生物學(xué)特性進(jìn)行免疫親和鑒定反應(yīng),最終CTC 表達(dá)EPCAM+/CK+/CD45-,與白細(xì)胞表達(dá)EPCAM-/CK-/CD45+被分離鑒定。本研究前期研究還通過對標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株的檢測實現(xiàn)90%以上檢測率,并將對臨床患者CTC 分選結(jié)果與CellSearch System 對比,發(fā)現(xiàn)該裝置的分選效率優(yōu)于CellSearch System,且在檢測成本、方便性、所需樣本量、檢測時間等方面均具備明顯優(yōu)勢[6]。
為實現(xiàn)該裝置的臨床應(yīng)用,本研究中應(yīng)用該裝置檢測了55 例臨床初治的惡性腫瘤患者CTC,CTC 陽性為29 例,檢出率為52.73%,通過χ2檢驗,發(fā)現(xiàn)CTC檢出率與腫瘤分化程度、腫瘤分期及臨床轉(zhuǎn)移相關(guān)(P <0.05),而與性別、年齡及癌種無關(guān)(P >0.05)。這與目前大多數(shù)臨床CTC檢測結(jié)果分析一致[17-21]。此外,本研究對接受治療的39 例患者進(jìn)行了治療后的CTC 復(fù)查,為臨床療效評價,予以完善胸腹部CT、乳腺、淺表淋巴結(jié)彩超等檢查,探討治療前后相同患者CTC檢測水平變化與影像學(xué)評效的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于CTC 數(shù)目升高26 例患者中,24 例出現(xiàn)了病情進(jìn)展,另2 例影像學(xué)評效縮小或穩(wěn)定,腫瘤標(biāo)志物出現(xiàn)輕度升高,不除外處于腫瘤進(jìn)展的早期,臨床嚴(yán)密觀察。而對于CTC 數(shù)目下降或不變的13 例患者,療效評價均為SD 或PR,Kappa檢驗提示二者的結(jié)果一致(P >0.05)。因此,本研究提出利用CTC的動態(tài)檢測可協(xié)助臨床療效的評價,指導(dǎo)治療,與現(xiàn)有臨床報導(dǎo)相符[22-26]。
因此,本研究提出CTC檢測有助于協(xié)助臨床評估腫瘤分化程度、預(yù)測分期、明確轉(zhuǎn)移,并起到療效評價、指導(dǎo)治療的作用。而本研究設(shè)計的基于微流控芯片的CTC檢測裝置具備檢測率高、檢測成本低、檢測方便等優(yōu)勢,有望實現(xiàn)CTC的臨床普及應(yīng)用,協(xié)助提高臨床患者診治率,提高患者生存質(zhì)量、延長生存期。