羅小露，謝寶剛，邱 芳，金 堤，宋志英，吳玉嬋，艾茂興，藍(lán) 玉，孫水林

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性流行，其中中國(guó)是世界上HBV感染者最多的國(guó)家[1]。長(zhǎng)期慢性感染可增加肝硬化以及肝細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，抗病毒治療是控制HBV慢性感染的最有效的方法，目前臨床上判斷抗病毒治療療效及停藥指標(biāo)主要是HBV DNA，但是仍有大部分患者需長(zhǎng)期服用藥物，即使是停藥后疾病活動(dòng)的重新激活也是非常常見的[2]，我們需要更優(yōu)的指標(biāo)去指導(dǎo)慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者抗病毒治療，隨著HBV RNA在患者血清中被發(fā)現(xiàn)[3]，HBV RNA成為現(xiàn)階段研究熱點(diǎn)。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)CHB患者在抗病毒治療不同階段血清中HBV RNA水平的變化來(lái)探討其可能存在的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究收集2015—2018年于南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染性疾病科門診或住院部確診并（或）開始抗病毒治療及治療后隨訪的75例CHB患者的病例資料。本研究為病例對(duì)照研究，入組患者納入標(biāo)準(zhǔn)為：①符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015更新版）》中CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；②確診為CHB且達(dá)到抗病毒治療指征使用恩替卡韋或干擾素抗病毒治療的患者；③確診為CHB且達(dá)到抗病毒治療指征使用干擾素抗病毒治療完成療程（48～ 96周）后達(dá)到病毒及生化應(yīng)答停藥觀察的患者。納入的75例患者根據(jù)治療不同階段分為：治療前、治療12周、治療48周、治療48周以上、停藥隨訪，并將治療不同階段的患者根據(jù)治療方案不同進(jìn)一步分為恩替卡韋治療12周、干擾素治療12周、恩替卡韋治療48周、干擾素治療48周、恩替卡韋治療48周以上、干擾素治療48周以上。

1.2 方法

收集患者的年齡、性別、HBV RNA及HBV DNA。使用全自動(dòng)核酸提取儀（S11A）、熒光定量PCR方法檢測(cè)血清HBV RNA水平（參考值＜100拷貝/mL），使用熒光定量PCR方法檢測(cè)患者血清HBV DNA水平（參考值＜500拷貝/mL）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 25.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。一般資料描述時(shí)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)及百分率（%），計(jì)量資料HBV DNA及HBV RNA水平用對(duì)數(shù)描述，低于檢測(cè)下限取0值。連續(xù)變量用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，各組間比較分類變量使用卡方檢驗(yàn)，個(gè)案數(shù)＜5時(shí)使用Fisher確切概率法，比較連續(xù)型變量使用非參數(shù)檢驗(yàn)，采用Spearman相關(guān)分析進(jìn)行變量之間的相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

75例患者根據(jù)治療不同階段分為：治療前（n=6）、治療12周（n=13）、治療48周（n=25）、治療48周以上（n=16）、停干擾素隨訪（n=15）。其中治療12周患者中恩替卡韋治療者6例，干擾素治療者7例；治療48周患者中恩替卡韋治療者8例，干擾素治療者17例；治療48周以上患者中恩替卡韋治療者8例，干擾素治療者8例。見表1。

表1 治療前與使用恩替卡韋或干擾素治療不同階段患者的一般資料比較Table 1 General information of patients before treatment and patients treated with entecavir or interferon

2.2 恩替卡韋治療不同階段HBV RNA和HBV DNA的滴度變化

使用恩替卡韋抗病毒治療12周、治療48周、治療48周以上患者的HBV RNA和HBV DNA的滴度均較治療前患者有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療12周與治療48周、治療48周與治療48周以上患者HBV RNA和HBV DNA的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

2.3 干擾素治療不同階段HBV RNA和HBV DNA的滴度變化

根據(jù)干擾素抗病毒不同階段分為治療前、治療12周、治療48周、治療48周以上。治療48周、治療48周以上患者HBV RNA水平較治療前患者均有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療12周與治療前、治療48周與治療12周、治療48周以上與治療48周的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；治療48周、治療48周以上患者HBV DNA水平低于治療前患者，治療48周患者HBV DNA水平低于治療12周患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但治療12周患者與治療前、治療48周以上與治療48周的HBV DNA的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

15例停藥觀察的患者中9例HBV DNA陰性，隨訪時(shí)間3～96個(gè)月，中位數(shù)為10（5，66）個(gè)月，6例HBV DNA陽(yáng)性，隨訪時(shí)間3～36個(gè)月，中位 數(shù)為13.5（3，27）個(gè)月，停藥隨訪HBV DNA陰性患者中HBV RNA陰性者4例，HBV RNA陽(yáng)性者5例，平均滴度水平為3.35 lg拷貝/mL，停藥隨訪HBV DNA陽(yáng)性患者中HBV RNA陰性1例，HBV RNA陽(yáng)性5例，平均滴度水平為6.44 lg 拷貝/mL。停藥隨訪HBV DNA陰性患者中HBV RNA陽(yáng)性者，其HBV RNA滴度水平顯著低于停藥隨訪HBV DNA陽(yáng)性患者中HBV RNA陽(yáng)性者的HBV RNA滴度水平（P=0.032）。

2.4 兩種抗病毒藥物治療不同階段的HBV RNA、HBV DNA的差異

使用恩替卡韋治療患者HBV DNA的滴度均較同一階段干擾素治療的患者低，治療12周時(shí)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在治療48周以上時(shí)，干擾素治療的HBV RNA較恩替卡韋低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3、圖4。

75例患者中，32例患者行干擾素抗病毒治療，其中HBV DNA陰性患者有13例，13例DNA陰性的患者中有11例患者HBV RNA陰性，占84.6%；22例恩替卡韋抗病毒患者中，HBV DNA陰性患者有18例，其中HBV RNA陰性患者有5例，占27.8%。干擾素治療患者中，HBV RNA、HBV DNA雙陰性者/HBV DNA陰性者的比值較恩替卡韋治療患者更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 HBV RNA與HBV DNA的相關(guān)性

75例患者分析顯示，對(duì)于治療前的患者，HBV RNA與HBV DNA無(wú)明顯相關(guān)性，治療12周及治療48周，可見HBV RNA與HBV DNA呈顯著正相關(guān)性（r=0.747，r=0.777，P＜0.05），當(dāng)治療48周以上時(shí)，二者無(wú)明顯相關(guān)（r=0.582，P＞ 0.05），停干擾素隨訪時(shí)，HBV RNA與HBV DNA呈正相關(guān)（r=0.574，P＜0.05）。22例使用恩替卡韋治療的患者，在整個(gè)抗病毒過(guò)程中，HBV RNA與HBV DNA均無(wú)顯著相關(guān)性，47例使用干擾素治療（其中包含15例停藥隨訪）的患者，在治療48周、48周以上、停藥隨訪時(shí)，HBV RNA與HBV DNA具有顯著相關(guān)性（r值分別為0.867、0.811、0.574，P＜0.05），治療12周時(shí)，HBV RNA 與HBV DNA無(wú)相關(guān)性。見表2。

表2 HBV RNA與HBV DNA的相關(guān)性Table 2 Correlation between HBV RNA and HBV DNA after treatment with entecavir or interferon

3 討論

目前抗HBV的藥物主要有核苷（酸）類似物及干擾素α，這些藥物都具有病毒抑制作用，而且干擾素還具有免疫調(diào)節(jié)作用[5]，但在HBV感染過(guò)程中，HBV cccDNA穩(wěn)定存在于細(xì)胞核中，難以被現(xiàn)有抗病毒藥物清除。由于cccDNA存在于肝細(xì)胞內(nèi)，只能通過(guò)肝穿刺活檢才能測(cè)得，而肝穿刺活檢作為一項(xiàng)有創(chuàng)性操作，難以在臨床全面開展，多項(xiàng)研究表明血清HBV RNA可以作為肝組織內(nèi)cccDNA活性的一種潛在血清學(xué)標(biāo)志物[6-9]。 本研究通過(guò)檢測(cè)抗病毒不同階段血清HBV RNA的含量，及其含量變化與HBV DNA的關(guān)系來(lái)研究HBV RNA在抗病毒治療中潛在的臨床意義。

研究結(jié)果顯示，無(wú)論是干擾素還是恩替卡韋抗病毒治療，HBV RNA及HBV DNA均有所下降，HBV DNA下降較HBV RNA快速且顯著，與Jansen等[10]研究結(jié)果相一致，這可能是因?yàn)闊o(wú)論恩替卡韋還是干擾素均可直接抑制HBV DNA生成，但不能直接抑制HBV RNA生成，HBV RNA的下降是由于HBV DNA的減少間接導(dǎo)致的。有研究分析顯示檢測(cè)HBV RNA可提示停藥后病毒復(fù)陽(yáng)的高風(fēng)險(xiǎn)性[11]，只有HBV RNA低于檢測(cè)下限，才能更有力說(shuō)明病毒復(fù)制得到控制。在干擾素停藥后呈持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答的患者中，血清HBV RNA水平處于檢測(cè)下限或低水平狀態(tài)，在干擾素停藥后出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)陽(yáng)的患者中，極大部分患者血清HBV RNA處于高水平狀態(tài)；提示停藥后HBV DNA復(fù)陽(yáng)時(shí)，HBV RNA亦有顯著上升。據(jù)此可推測(cè)，兩者聯(lián)合檢測(cè)有利于停藥后早期預(yù)測(cè)病毒學(xué)復(fù)陽(yáng)。

針對(duì)不同抗病毒方式進(jìn)行分析，本研究發(fā)現(xiàn)恩替卡韋較干擾素降病毒速度更快。但是降HBV RNA效果不及干擾素。32例干擾素抗病毒治療患者中，HBV RNA、HBV DNA雙陰性患者占HBV DNA陰性患者84.6%；22例恩替卡韋抗病毒治療患者中，HBV RNA、HBV DNA雙陰性患者占HBV DNA陰性患者27.8%。用干擾素治療，當(dāng)HBV DNA陰轉(zhuǎn)時(shí)，HBV RNA陰轉(zhuǎn)率明顯高于恩替卡韋治療患者（84.6%對(duì)27.8%，P=0.003，P＜0.05），提示在抗病毒治療中，干擾素HBV RNA總體效果優(yōu)于恩替卡韋。Yu等[12]測(cè)定了178例接受恩替卡韋或聚乙二醇干擾素治療的CHB患者的系列血清樣本中HBV RNA水平也得出類似結(jié)果。這可能是因?yàn)楦蓴_素還具有免疫調(diào)節(jié)作用[5]。 研究結(jié)果表明，HBV RNA的下降與治療藥物不同相關(guān)，干擾素降HBV RNA效果強(qiáng)于恩替卡韋，HBV RNA在干擾素治療的患者中能更好地預(yù)測(cè)治療效果。

隨著HBV RNA在患者血清中的檢出，其與HBV DNA之間的關(guān)系也備受關(guān)注，兩者之間的相關(guān)性受抗病毒藥物影響[13]，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著治療時(shí)間增加，相關(guān)性減弱甚至消失。但在恩替卡韋治療患者中，我們并未發(fā)現(xiàn)HBV RNA與HBV DNA之間的相關(guān)性，這可能是因?yàn)樵谥委?2周時(shí)，絕大部分患者HBV DNA已低于檢測(cè)下限。其他研究亦得出類似結(jié)果，經(jīng)恩替卡韋治療后HBV RNA與HBV DNA的相關(guān)性明顯減弱[14]。干擾素治療12周的患者中，我們亦未發(fā)現(xiàn)HBV RNA與HBV DNA顯著相關(guān)性，可能與HBV RNA、HBV DNA均處于高水平狀態(tài)，患者與患者之間的水平差異較小相關(guān)。但是在治療48周及治療48周以上均發(fā)現(xiàn)HBV RNA與HBV DNA的顯著相關(guān)性，且相關(guān)性呈減弱趨勢(shì)（r=0.867，r=0.811），目前尚未發(fā)現(xiàn)干擾素治療過(guò)程中HBV RNA與HBV DNA的相關(guān)性研究，此項(xiàng)結(jié)果說(shuō)明，在治療后期，尤其是當(dāng)HBV DNA陰轉(zhuǎn)后，可以進(jìn)一步根據(jù)HBV RNA的下降判斷治療效果。

綜上可知，血清HBV RNA水平變化因治療方法及治療時(shí)間不同而有所差異，在整個(gè)抗病毒治療過(guò)程中，HBV RNA水平總體呈下降趨勢(shì)，下降速度較HBV DNA慢，與HBV DNA具有相關(guān)性，且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒數(shù)量的減低，相關(guān)性有減弱趨勢(shì)，在評(píng)估抗病毒治療療效上，尤其是對(duì)于干擾素治療的患者，具有一定的臨床價(jià)值。