李燕 王芳 諶燃 賈淇媛 周海峰

【關(guān)鍵詞】海藻酸鈉;酪氨酸酶;抑制作用;黑色素合成

酪氨酸酶對(duì)人體皮膚組織有不良影響，可使皮膚中黑色素增加，容易引發(fā)雀斑、黃褐斑、黑色素瘤等皮膚病，對(duì)健康造成不良影響[1]。當(dāng)前很多化妝品中具有色素沉著和安全抑制劑。很多天然化合物中均含有能夠與酶相結(jié)合的抑制劑與底物，但是在使用過(guò)程中容易出現(xiàn)難以有效分解的現(xiàn)象[2]。對(duì)酪氨酸酶活性能夠起到良好抑制效果的自然產(chǎn)物有香豆素、黃酮及其衍生物、生物堿、萜類、苷類物品等，但是在物品使用過(guò)程中需要考慮到如何進(jìn)行提取以及提取成本的問(wèn)題，因此整體經(jīng)濟(jì)實(shí)用性不強(qiáng)[3]。本研究分析了海藻酸鈉的應(yīng)用方式、化學(xué)結(jié)構(gòu)，對(duì)抑制酪氨酸酶活性合成的作用情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.1 儀器與試劑 美國(guó)PerkinElmer公司出產(chǎn)的LS55熒光/磷光分光光度計(jì)、Lambda900紫外-可見分光光度計(jì)，以及美國(guó)Bio-Rad公司出產(chǎn)的680酶標(biāo)儀。上海阿拉丁生化公司生產(chǎn)的海藻酸鈉、曲拉通X-100、酪氨酸酶、左旋多巴;北京鼎國(guó)昌盛公司生產(chǎn)的PBS磷酸鹽緩沖液、MTT噻唑蘭;美國(guó)ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室提供的黑素細(xì)胞專用培養(yǎng)基、黑素細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1測(cè)定酪氨酸酶活性 在3 ml 50 mmol/L PBS中添加2.9 ml 1 mmol/L左旋多巴溶液，將混合溶液放入32 ℃水浴，保溫處理20 min。之后添加0.1 ml酪氨酸酶溶液，將混合溶液搖勻，在恒溫環(huán)境下測(cè)量在不同時(shí)間點(diǎn)混合液吸光度變化情況。

1個(gè)酪氨酸酶活力單位判斷標(biāo)準(zhǔn)為1 min內(nèi)混合溶液中475 nm波長(zhǎng)吸光度值變動(dòng)超過(guò)0.001。

1.2.2測(cè)定酪氨酸酶抑制率 配置0.25、0.5、2、4、8、16、32、64 mmol/L濃度海藻酸鈉溶液，將2.8 ml 1 mmol/L左旋多巴溶液與0.1 ml以上不同濃度海藻酸鈉溶液進(jìn)行充分混合。將制作完成的混合溶液放入32 ℃水浴，保溫處理20 min。之后添加0.1 ml酪氨酸酶溶液，將混合溶液充分搖勻之后，在室溫狀態(tài)下測(cè)量以上不同濃度溶液在475 nm處的吸光度，收集實(shí)驗(yàn)中得到的各項(xiàng)數(shù)值，制作吸光度-時(shí)間曲線。通過(guò)以下公式得出抑制率（R）：R=（1-S1/S0）×100%。在該公式中，海藻酸鈉溶液添加之后的曲線斜率以S1表示，酪氨酸酶抑制率表示以R表示，沒(méi)有海藻酸溶液添加的溶液繪制的曲線斜率以S0表示。

1.2.3培養(yǎng)黑素細(xì)胞 通過(guò)黑素細(xì)胞專用培養(yǎng)基進(jìn)行黑素細(xì)胞培養(yǎng)，將其放入37 ℃ 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱之中培養(yǎng)，在細(xì)胞滿足對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期條件下開展實(shí)驗(yàn)。

1.2.4黑素細(xì)胞中酪氨酸酶活性的抑制 設(shè)置每孔8000個(gè)密度，將黑素細(xì)胞放入96孔板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)12 h之后，在96孔板中加入不等量海藻酸鈉。至72 h培養(yǎng)之后，對(duì)黑素細(xì)胞進(jìn)行洗滌處理，使用PBS進(jìn)行清洗。將50 μl1%曲拉通X-100加入96孔板之中。將處理完成的黑素細(xì)胞放入-80 ℃冰箱環(huán)境下放置30 min。在室溫狀態(tài)下，取出黑素細(xì)胞分析。在黑素細(xì)胞破裂同時(shí)溫度達(dá)到37 ℃之后，將50 μl0.2%左旋多巴添加至黑素細(xì)胞之中。使用外-可見分光光度測(cè)量475 nm位置中的吸光度值。計(jì)算酪氨酸酶活性抑制率。

1.2.5海藻酸鈉的細(xì)胞毒性 設(shè)置每孔8000個(gè)細(xì)胞密度，進(jìn)行黑素細(xì)胞培養(yǎng)，設(shè)置96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。將0.25、2、16、64 mmol/L加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板之中。每一個(gè)細(xì)胞板設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。在完成24、72 h細(xì)胞培養(yǎng)之后，通過(guò)MTT法分析細(xì)胞活性。

2.1 酪氨酸酶活性分析 酪氨酸酶在32 ℃環(huán)境下能夠催化左旋多巴，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間逐漸增加的同時(shí)，能夠產(chǎn)生吸光度曲線。在實(shí)驗(yàn)時(shí)間增加時(shí)，產(chǎn)物生成量隨之相應(yīng)增加。進(jìn)行數(shù)值計(jì)算：y=0.0055x+0.0020（R 2=0.9949）?？梢?，時(shí)間與產(chǎn)物生成量具有較高的相關(guān)性，酪氨酸酶大小數(shù)值即曲線斜率，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行酪氨酸酶保持較為穩(wěn)定的活性，見圖1。

2.2 海藻酸鈉對(duì)酪氨酸酶的抑制作用 海藻酸鈉能夠顯著抑制酪氨酸酶活性，降低產(chǎn)物產(chǎn)量。海藻酸鈉濃度小于20 mmol/L時(shí)，濃度越高，抑制效果越好，表現(xiàn)出濃度依賴型抑制特征。海藻酸鈉濃度超過(guò)20 mmol/L時(shí)，其對(duì)酪氨酸酶產(chǎn)生的活性抑制率為65.45%，此時(shí)基本上達(dá)到一個(gè)確定的數(shù)值，濃度繼續(xù)增加酪氨酸酶活性抑制率不會(huì)產(chǎn)生較大變化。共同培養(yǎng)黑素細(xì)胞與海藻酸鈉，其對(duì)黑素細(xì)胞也具有一定的抑制作用。但是所起到的抑制效果不如直接添加至酪氨酸酶體系之中，主要是由于細(xì)胞體系內(nèi)部復(fù)雜的環(huán)境。海藻酸鈉能夠通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)行細(xì)胞交換，其內(nèi)部組成成分較為復(fù)雜，不利于活性抑制效果的達(dá)成。但是依然能夠產(chǎn)生一定的活性抑制效果。因此，海藻酸鈉在體外能夠達(dá)到更為良好的應(yīng)用效果。因此當(dāng)前色素紊亂性防治藥劑及化妝品中加入了海藻酸鈉，具有此作用機(jī)理。

2.3 海藻酸鈉對(duì)黑色素合成的影響 隨著海藻酸鈉濃度的增加，對(duì)胞內(nèi)黑色素生成抑制率也隨之上升，能夠有效降低黑色素生成量，其作用原理為酪氨酸酶是合成黑色素的限速酶。本次研究中曲酸對(duì)黑素細(xì)胞中黑色素生成也具有一定的抑制作用，但是綜合效果不如海藻酸鈉。同時(shí)曲酸的應(yīng)用對(duì)人體具有一定的致癌風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利，因此綜合分析海藻酸鈉對(duì)抑制黑色素合成具有良好的效果，見圖2。

2.4 海藻酸鈉對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用 研究不同濃度海藻酸鈉下酪氨酸酶熒光發(fā)射光譜，可見隨之海藻酸鈉濃度的增加，酪氨酸酶內(nèi)源熒光強(qiáng)度隨之降低，說(shuō)明酪氨酸酶與海藻酸鈉的聯(lián)合作用在一定程度上減弱了酪氨酸酶內(nèi)源性熒光。酪氨酸酶發(fā)射波長(zhǎng)最大可達(dá)295 nm，但是在加入海藻酸鈉之后，最大發(fā)射波長(zhǎng)有所降低，因此海藻酸鈉與酪氨酸酶的相互作用對(duì)氨基酸殘基疏水性環(huán)境產(chǎn)生了一定的破壞性。酪氨酸酶包括多個(gè)亞基，亞基中包括金屬銅離子，金屬銅離子能夠與氨酸殘基結(jié)合而固定于酶活性中心，金屬銅離子與氨酸殘基之間通過(guò)內(nèi)源氧橋連接，此即酪氨酸酶催化反應(yīng)活性中心。同時(shí)酪氨酸酶銅離子吸附性能極佳，能夠有效激發(fā)酪氨酸酶活性位點(diǎn)的銅，使得酪氨酸酶不可逆的失活。外在表現(xiàn)上酪氨酸酶結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一定變化，即內(nèi)源性熒光光譜紅移，因此證明了海藻酸鈉的活性抑制效果，見圖3。

2.5 海藻酸鈉細(xì)胞毒性分析 探討海藻酸鈉使用過(guò)程中的毒性，當(dāng)前該材料已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)用相關(guān)產(chǎn)品之中，成為了一種較為常見的制備藥物載體材料，在創(chuàng)傷口敷料、組織工程支架等領(lǐng)域中均廣泛應(yīng)用。在使用過(guò)程中能夠與其他相關(guān)材料有效融合，生物相容性較為良好。在已知具有以上作用機(jī)理的同時(shí)，分析海藻酸鈉的使用是否會(huì)造成不良影響，對(duì)人體組織細(xì)胞是否具有毒性。海藻酸鈉對(duì)黑素細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)中所設(shè)置的濃度之內(nèi)，海藻酸鈉對(duì)黑素細(xì)胞細(xì)胞活性超過(guò)90%，未產(chǎn)生明顯毒性，見圖4。

海藻酸鈉來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，是一種優(yōu)良的天然產(chǎn)物[6]。同時(shí)，海藻酸鈉已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)，表明其具有良好的生物安全性[7]。更重要的是海藻酸鈉中含有豐富的羥基、羧基和羰基，有可能對(duì)酪氨酸酶形成混合型抑制作用[8]。此外，酪氨酸酶活性還與環(huán)境中銅離子含量相關(guān)，海藻酸鈉吸附銅離子的能力較強(qiáng)，同樣可從這條途徑抑制酪氨酸酶活性[9]。由此可見，海藻酸鈉極有可能成為天然、高效、安全、經(jīng)濟(jì)的酪氨酸酶抑制劑，從而防止黑色素的過(guò)度沉積[10，11]。但目前未見文獻(xiàn)報(bào)道海藻酸鈉對(duì)酪氨酸酶活性抑制方面的研究。因此，本研究擬通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)海藻酸鈉的酪氨酸酶抑制作用，并闡明其抑制機(jī)制，同時(shí)評(píng)價(jià)海藻酸鈉的生物相容性，為其在美白化妝品中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

本研究開展了酶抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，從多個(gè)層面證明了海藻酸鈉度對(duì)酪氨酸酶的活性抑制效果。同時(shí)對(duì)黑素細(xì)胞活性同樣能夠起到一定的抑制效果。在使用過(guò)程中能夠有效抑制黑素細(xì)胞內(nèi)黑色素生成，一般隨著海藻酸鈉度濃度的增加抑制效果逐漸增強(qiáng)[12，13]。熒光光譜可見酪氨酸酶與海藻酸鈉的聯(lián)合作用減弱了酪氨酸酶內(nèi)源性熒光，能夠在一定程度上破壞氨基酸殘基疏水性環(huán)境，同時(shí)也存在著混合性抑制。通過(guò)黑素細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)可見海藻酸鈉的生物相容性良好[14]。

綜上所述， 海藻酸鈉是一種較為良好的酪氨酸酶活性抑制劑，能夠有效抑制黑色素生成，可應(yīng)用于皮膚相關(guān)疾病治療藥劑及美白化妝產(chǎn)品之中。