李燕 王芳 諶燃 賈淇媛 周海峰

【關鍵詞】海藻酸鈉;酪氨酸酶;抑制作用;黑色素合成

酪氨酸酶對人體皮膚組織有不良影響，可使皮膚中黑色素增加，容易引發(fā)雀斑、黃褐斑、黑色素瘤等皮膚病，對健康造成不良影響[1]。當前很多化妝品中具有色素沉著和安全抑制劑。很多天然化合物中均含有能夠與酶相結合的抑制劑與底物，但是在使用過程中容易出現難以有效分解的現象[2]。對酪氨酸酶活性能夠起到良好抑制效果的自然產物有香豆素、黃酮及其衍生物、生物堿、萜類、苷類物品等，但是在物品使用過程中需要考慮到如何進行提取以及提取成本的問題，因此整體經濟實用性不強[3]。本研究分析了海藻酸鈉的應用方式、化學結構，對抑制酪氨酸酶活性合成的作用情況，現報道如下。

1.1 儀器與試劑 美國PerkinElmer公司出產的LS55熒光/磷光分光光度計、Lambda900紫外-可見分光光度計，以及美國Bio-Rad公司出產的680酶標儀。上海阿拉丁生化公司生產的海藻酸鈉、曲拉通X-100、酪氨酸酶、左旋多巴;北京鼎國昌盛公司生產的PBS磷酸鹽緩沖液、MTT噻唑蘭;美國ScienCell研究實驗室提供的黑素細胞專用培養(yǎng)基、黑素細胞。

1.2 方法

1.2.1測定酪氨酸酶活性 在3 ml 50 mmol/L PBS中添加2.9 ml 1 mmol/L左旋多巴溶液，將混合溶液放入32 ℃水浴，保溫處理20 min。之后添加0.1 ml酪氨酸酶溶液，將混合溶液搖勻，在恒溫環(huán)境下測量在不同時間點混合液吸光度變化情況。

1個酪氨酸酶活力單位判斷標準為1 min內混合溶液中475 nm波長吸光度值變動超過0.001。

1.2.2測定酪氨酸酶抑制率 配置0.25、0.5、2、4、8、16、32、64 mmol/L濃度海藻酸鈉溶液，將2.8 ml 1 mmol/L左旋多巴溶液與0.1 ml以上不同濃度海藻酸鈉溶液進行充分混合。將制作完成的混合溶液放入32 ℃水浴，保溫處理20 min。之后添加0.1 ml酪氨酸酶溶液，將混合溶液充分搖勻之后，在室溫狀態(tài)下測量以上不同濃度溶液在475 nm處的吸光度，收集實驗中得到的各項數值，制作吸光度-時間曲線。通過以下公式得出抑制率（R）：R=（1-S1/S0）×100%。在該公式中，海藻酸鈉溶液添加之后的曲線斜率以S1表示，酪氨酸酶抑制率表示以R表示，沒有海藻酸溶液添加的溶液繪制的曲線斜率以S0表示。

1.2.3培養(yǎng)黑素細胞 通過黑素細胞專用培養(yǎng)基進行黑素細胞培養(yǎng)，將其放入37 ℃ 5%CO2的細胞培養(yǎng)箱之中培養(yǎng)，在細胞滿足對數生長期條件下開展實驗。

1.2.4黑素細胞中酪氨酸酶活性的抑制 設置每孔8000個密度，將黑素細胞放入96孔板中進行實驗，經過12 h之后，在96孔板中加入不等量海藻酸鈉。至72 h培養(yǎng)之后，對黑素細胞進行洗滌處理，使用PBS進行清洗。將50 μl1%曲拉通X-100加入96孔板之中。將處理完成的黑素細胞放入-80 ℃冰箱環(huán)境下放置30 min。在室溫狀態(tài)下，取出黑素細胞分析。在黑素細胞破裂同時溫度達到37 ℃之后，將50 μl0.2%左旋多巴添加至黑素細胞之中。使用外-可見分光光度測量475 nm位置中的吸光度值。計算酪氨酸酶活性抑制率。

1.2.5海藻酸鈉的細胞毒性 設置每孔8000個細胞密度，進行黑素細胞培養(yǎng)，設置96孔細胞培養(yǎng)板。將0.25、2、16、64 mmol/L加入96孔細胞培養(yǎng)板之中。每一個細胞板設置6個復孔。在完成24、72 h細胞培養(yǎng)之后，通過MTT法分析細胞活性。

2.1 酪氨酸酶活性分析 酪氨酸酶在32 ℃環(huán)境下能夠催化左旋多巴，在實驗時間逐漸增加的同時，能夠產生吸光度曲線。在實驗時間增加時，產物生成量隨之相應增加。進行數值計算：y=0.0055x+0.0020（R 2=0.9949）?？梢?，時間與產物生成量具有較高的相關性，酪氨酸酶大小數值即曲線斜率，實驗進行酪氨酸酶保持較為穩(wěn)定的活性，見圖1。

2.2 海藻酸鈉對酪氨酸酶的抑制作用 海藻酸鈉能夠顯著抑制酪氨酸酶活性，降低產物產量。海藻酸鈉濃度小于20 mmol/L時，濃度越高，抑制效果越好，表現出濃度依賴型抑制特征。海藻酸鈉濃度超過20 mmol/L時，其對酪氨酸酶產生的活性抑制率為65.45%，此時基本上達到一個確定的數值，濃度繼續(xù)增加酪氨酸酶活性抑制率不會產生較大變化。共同培養(yǎng)黑素細胞與海藻酸鈉，其對黑素細胞也具有一定的抑制作用。但是所起到的抑制效果不如直接添加至酪氨酸酶體系之中，主要是由于細胞體系內部復雜的環(huán)境。海藻酸鈉能夠通過細胞膜進行細胞交換，其內部組成成分較為復雜，不利于活性抑制效果的達成。但是依然能夠產生一定的活性抑制效果。因此，海藻酸鈉在體外能夠達到更為良好的應用效果。因此當前色素紊亂性防治藥劑及化妝品中加入了海藻酸鈉，具有此作用機理。

2.3 海藻酸鈉對黑色素合成的影響 隨著海藻酸鈉濃度的增加，對胞內黑色素生成抑制率也隨之上升，能夠有效降低黑色素生成量，其作用原理為酪氨酸酶是合成黑色素的限速酶。本次研究中曲酸對黑素細胞中黑色素生成也具有一定的抑制作用，但是綜合效果不如海藻酸鈉。同時曲酸的應用對人體具有一定的致癌風險，對細胞生長不利，因此綜合分析海藻酸鈉對抑制黑色素合成具有良好的效果，見圖2。

2.4 海藻酸鈉對酪氨酸酶活性的抑制作用 研究不同濃度海藻酸鈉下酪氨酸酶熒光發(fā)射光譜，可見隨之海藻酸鈉濃度的增加，酪氨酸酶內源熒光強度隨之降低，說明酪氨酸酶與海藻酸鈉的聯合作用在一定程度上減弱了酪氨酸酶內源性熒光。酪氨酸酶發(fā)射波長最大可達295 nm，但是在加入海藻酸鈉之后，最大發(fā)射波長有所降低，因此海藻酸鈉與酪氨酸酶的相互作用對氨基酸殘基疏水性環(huán)境產生了一定的破壞性。酪氨酸酶包括多個亞基，亞基中包括金屬銅離子，金屬銅離子能夠與氨酸殘基結合而固定于酶活性中心，金屬銅離子與氨酸殘基之間通過內源氧橋連接，此即酪氨酸酶催化反應活性中心。同時酪氨酸酶銅離子吸附性能極佳，能夠有效激發(fā)酪氨酸酶活性位點的銅，使得酪氨酸酶不可逆的失活。外在表現上酪氨酸酶結構呈現出一定變化，即內源性熒光光譜紅移，因此證明了海藻酸鈉的活性抑制效果，見圖3。

2.5 海藻酸鈉細胞毒性分析 探討海藻酸鈉使用過程中的毒性，當前該材料已經被廣泛應用于生物醫(yī)用相關產品之中，成為了一種較為常見的制備藥物載體材料，在創(chuàng)傷口敷料、組織工程支架等領域中均廣泛應用。在使用過程中能夠與其他相關材料有效融合，生物相容性較為良好。在已知具有以上作用機理的同時，分析海藻酸鈉的使用是否會造成不良影響，對人體組織細胞是否具有毒性。海藻酸鈉對黑素細胞毒性的實驗研究結果顯示，在實驗中所設置的濃度之內，海藻酸鈉對黑素細胞細胞活性超過90%，未產生明顯毒性，見圖4。

海藻酸鈉來源廣泛，價格低廉，是一種優(yōu)良的天然產物[6]。同時，海藻酸鈉已廣泛應用于食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)，表明其具有良好的生物安全性[7]。更重要的是海藻酸鈉中含有豐富的羥基、羧基和羰基，有可能對酪氨酸酶形成混合型抑制作用[8]。此外，酪氨酸酶活性還與環(huán)境中銅離子含量相關，海藻酸鈉吸附銅離子的能力較強，同樣可從這條途徑抑制酪氨酸酶活性[9]。由此可見，海藻酸鈉極有可能成為天然、高效、安全、經濟的酪氨酸酶抑制劑，從而防止黑色素的過度沉積[10，11]。但目前未見文獻報道海藻酸鈉對酪氨酸酶活性抑制方面的研究。因此，本研究擬通過實驗證實海藻酸鈉的酪氨酸酶抑制作用，并闡明其抑制機制，同時評價海藻酸鈉的生物相容性，為其在美白化妝品中的應用提供理論基礎和實驗數據。

本研究開展了酶抑制動力學實驗，從多個層面證明了海藻酸鈉度對酪氨酸酶的活性抑制效果。同時對黑素細胞活性同樣能夠起到一定的抑制效果。在使用過程中能夠有效抑制黑素細胞內黑色素生成，一般隨著海藻酸鈉度濃度的增加抑制效果逐漸增強[12，13]。熒光光譜可見酪氨酸酶與海藻酸鈉的聯合作用減弱了酪氨酸酶內源性熒光，能夠在一定程度上破壞氨基酸殘基疏水性環(huán)境，同時也存在著混合性抑制。通過黑素細胞毒性實驗可見海藻酸鈉的生物相容性良好[14]。

綜上所述， 海藻酸鈉是一種較為良好的酪氨酸酶活性抑制劑，能夠有效抑制黑色素生成，可應用于皮膚相關疾病治療藥劑及美白化妝產品之中。