田程程，張 晶，符 璐，蔣蘇蘇,2，武殿虎，盧建雄，張國(guó)華*

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730020）

脂肪形成是前體脂肪細(xì)胞增殖及分化為成熟脂肪細(xì)胞的復(fù)雜過(guò)程。在經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化后前體脂肪細(xì)胞分化脂肪細(xì)胞，參與脂肪合成、脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及胰島素信號(hào)應(yīng)答等多種生物學(xué)過(guò)程。脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加和體積的增大是動(dòng)物體脂沉積的生物學(xué)基礎(chǔ)，其調(diào)控機(jī)制備受關(guān)注。遺傳因子、營(yíng)養(yǎng)、氧化還原狀態(tài)等多種內(nèi)、外環(huán)境因素都會(huì)影響脂肪細(xì)胞分化。維生素D不僅作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以調(diào)節(jié)鈣磷代謝，也具有調(diào)節(jié)免疫功能、抑制腫瘤生長(zhǎng)和調(diào)控細(xì)胞分化發(fā)揮激素類物質(zhì)的作用。它是一組具有生物活性的脂溶性類固醇衍生物[1]，在肝臟經(jīng)25-羥化酶CYP2R1和CYP27A1作用轉(zhuǎn)變成25(OH)D3，然后在腎臟由1α羥化酶CYP27B1催化為1,25(OH)2D3。24-羥化酶CYP24A1可將1,25(OH)2D3分解為水溶性代謝產(chǎn)物d3-23羧酸（calcitroic acid）排出體外。25(OH)D3和1,25(OH)2D3是維生素D主要的生物活性形式，也是維生素D受體（Vitamin Dreceptor）的天然配體[2]。當(dāng)1,25(OH)2D3與其受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞增殖、分化及凋亡相關(guān)基因表達(dá)[3]。1,25(OH)2D3以劑量依賴方式下調(diào)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）及其下游脂代謝相關(guān)基因LPL和aP2等的表達(dá)，抑制成脂分化[4]。用25(OH)D3或1,25(OH)2D3處理可抑制乳腺前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的啟動(dòng)[5]。脂肪組織是維生素D主要的貯存場(chǎng)所之一，日糧多不飽和脂肪酸通過(guò)調(diào)控維生素代謝酶的表達(dá)影響豬脂肪組織維生素D代謝，從而調(diào)節(jié)脂肪合成[6]。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的1,25(OH)2D3通過(guò)降低PPARγ的表達(dá)，可減弱豬前體脂肪細(xì)胞分化，但高濃度的1,25(OH)2D3通過(guò)提高PPARγ的表達(dá)，可增強(qiáng)分化[7]，但其作用機(jī)制尚不清楚。

硫氧還蛋白（thioredoxin,Trx）氧化還原系統(tǒng)是機(jī)體重要的抗氧化系統(tǒng)，參與細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)[8]，對(duì)機(jī)體健康和代謝起著重要作用。硫氧還蛋白互作蛋白（Txnip）是一種維生素D3上調(diào)蛋白1（Vitamin D3up-regulated protein 1,VDUP1），可通過(guò)抑制硫氧還蛋白的還原活性調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)[9]，調(diào)控脂肪細(xì)胞分化[10]。因此，維生素D可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞氧化還原影響脂肪細(xì)胞分化。本試驗(yàn)通過(guò)分離培養(yǎng)豬前體脂肪細(xì)胞，分析不同濃度1,25(OH)2D3對(duì)細(xì)胞分化及氧化還原平衡狀態(tài)的影響，探討維生素D調(diào)控豬脂肪細(xì)胞分化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

牛血清白蛋白（Gibco，美國(guó)）；地塞米松（DEX）、1,25(OH)2D3、胰島素（Sigma公司）；DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清（HyClone，美國(guó)）；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、油紅O、臺(tái)盼藍(lán)和DMSO（Solarbio公司，北京）；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）；PCR引物由上海生工生物工程公司合成；3日齡仔豬（Sus scrofa）購(gòu)自蘭州瑞源農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 皮下前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 3日齡仔豬體表清洗、消毒后乙醚麻醉處死，按本實(shí)驗(yàn)室已建立的脂肪細(xì)胞分離、培養(yǎng)方法[11]，無(wú)菌條件解剖分離皮下脂肪組織，PBS漂洗，剪成組織小塊，用濃度1%的Ⅰ型膠原酶在37 ℃水浴中消化60 min左右后，等體積完全培養(yǎng)液終止消化，100目篩網(wǎng)過(guò)濾。收集濾液，1 000 r/min離心10 min，沉淀用培養(yǎng)液漂洗后，用10%血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，然后以6×104/cm2密度接種于24孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液。細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%匯合后，用成脂分化培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，然后換用1,25(OH)2D3終濃度為0 nmol/L（對(duì)照）、0.1 nmol/L和100 nmol/L的維持培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔日換液，于成脂誘導(dǎo)后2 d、4 d、6 d、8 d和10 d檢測(cè)細(xì)胞分化及提取總RNA。

1.2.2 油紅O染色提取法檢測(cè)細(xì)胞分化 分別在誘導(dǎo)成脂分化的2 d、4 d和6 d，按于淇等[10]報(bào)道的油紅O染色提取法，測(cè)定為510 nm的吸光度值。

1.2.3 細(xì)胞氧化還原指標(biāo)檢測(cè) 誘導(dǎo)分化后第6 d，在每孔細(xì)胞中加入1 ml胰酶消化，收集細(xì)胞，用冰冷的PBS洗滌3次后，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，4 ℃、1 000 r/min離心10 min，收集上清液，用豬活性氧（ROS）、還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（上海江萊生物科技有限公司），按照使用說(shuō)明書測(cè)定ROS、GSH和GSSG。

1.2.4 基因mRNA表達(dá)檢測(cè) 誘導(dǎo)分化6 d的細(xì)胞棄培養(yǎng)液后，用試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按生產(chǎn)商使用說(shuō)明書，制備實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)混合液（20 μl），包括上、下游引物（10 μmol/L）各1 μl、cDNA 2 μl。引物信息見(jiàn)表1，反應(yīng)程序見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平，β-actin作為內(nèi)參。

表1 引物序列

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Duncan's法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 1,25(OH)2D3對(duì)豬前體脂肪細(xì)胞分化的影響

豬前體脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后，分別以0.1 nmol/L和100 nmol/L 1,25(OH)2D3處理。成脂誘導(dǎo)6 d后脂肪細(xì)胞油紅O染色結(jié)果見(jiàn)圖1。在成脂誘導(dǎo)2 d、4 d和6 d后，0.1 nmol/L 1,25(OH)2D3處理組細(xì)胞的分化水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），而100 nmol/L 1,25(OH)2D3處理組細(xì)胞的分化水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖2）?？梢?jiàn)，低濃度1,25(OH)2D3抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化，高濃度1,25(OH)2D3促進(jìn)分化。

圖1 成脂誘導(dǎo)6 d后豬脂肪細(xì)胞油紅O染色結(jié)果

圖2 1,25(OH)2D3對(duì)豬脂肪細(xì)胞分化的影響

2.2 1,25(OH)2D3對(duì)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響

1,25(OH)2D3處理的豬前體脂肪細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)6 d后，檢測(cè)細(xì)胞ROS、GSH和GSSG水平，結(jié)果如表2所示。與對(duì)照組相比，0.1 nmol/L濃度1,25(OH)2D3處理極顯著提高細(xì)胞ROS和GSSG水平（P＜0.01），極顯著降低GSH水平及GSH/GSSG比值（P＜0.01），而100 nmol/L濃度1,25(OH)2D3處理極顯著降低細(xì)胞ROS和GSSG水平（P＜0.01），極顯著提高GSH水平及GSH/GSSG比值（P＜0.01）。

表2 1,25(OH)2D3對(duì)豬前體脂肪細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響

2.3 1,25(OH)2D3對(duì)細(xì)胞氧化還原相關(guān)基因表達(dá)的影響

采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)誘導(dǎo)分化后6 d脂肪細(xì)胞Trx、SOD2和Prx3mRNA表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組相比，0.1 nmol/L濃度1,25(OH)2D3處理和100 nmol/L濃度1,25(OH)2D3處理均極顯著降低Trx mRNA表達(dá)（P＜0.01）；100 nmol/L 1,25(OH)2D3處理顯著上調(diào)SOD2和Prx3mRNA表達(dá)，但0.1 nmol/L 1,25(OH)2D3對(duì)其表達(dá)影響不顯著。

圖3 1,25(OH)2D3對(duì)豬脂肪細(xì)胞氧化還原相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

脂肪組織是動(dòng)物體內(nèi)維生素D貯存的主要組織之一，其活性形式1,25(OH)2D3也以自分泌和旁分泌方式影響脂肪形成[12]。對(duì)嚙齒動(dòng)物來(lái)源的前體脂肪細(xì)胞3T3-L1和PA6等的研究表明，1,25(OH)2D3抑制其成脂分化及脂滴聚集[4]。Ji等[13]發(fā)現(xiàn)10～100 nmol/L濃度1,25(OH)2D3通過(guò)降低成脂關(guān)鍵因子PPARγ及其下游脂代謝相關(guān)基因表達(dá)，抑制3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化。盡管1,25(OH)2D3以劑量依賴方式降低PPARγ和C/EBPα表達(dá)，抑制3T3-L1細(xì)胞分化，但這種作用只發(fā)生在成脂分化起始階段[4]。100 nmol/L 1,25(OH)2D3抑制3T3-L1細(xì)胞分化，但促進(jìn)小鼠和人類原代培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞分化及PPARγ表達(dá)[14]。不同濃度1,25(OH)2D3對(duì)Ob17細(xì)胞成脂分化有不同的影響，低濃度時(shí)促進(jìn)分化，高濃度時(shí)抑制分化[15]。但Lenoir等[16]得到相反結(jié)果，即維生素D濃度大于0.25 nmol/L時(shí)促進(jìn)Ob17細(xì)胞分化，小于0.25 nmol/L時(shí)抑制分化。此外，1,25(OH)2D3以劑量依賴方式抑制豬皮下前體脂肪細(xì)胞分化[17]，但促進(jìn)豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化[18]。這些研究結(jié)果的分歧可能與細(xì)胞來(lái)源及1,25(OH)2D3的濃度有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度（0.1 nmol/L）1,25(OH)2D3抑制豬皮下前體脂肪細(xì)胞分化，而高濃度（100 nmol/L）促進(jìn)分化。與此一致，岳小婧等[7]報(bào)道0.1～1 nmol/L 1,25(OH)2D3抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化，而濃度為10～100 nmol/L時(shí)促進(jìn)分化。

氧化還原系統(tǒng)是生物體內(nèi)的一種重要調(diào)節(jié)機(jī)制，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。氧化還原狀態(tài)是超氧陰離子（O2?）、過(guò)氧化氫（H2O2）、羥基自由基（OH）等活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）、二氧化氮（NO2）等活性氮（RNS），與酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)組成的抗氧化防御系統(tǒng)之間相互作用的結(jié)果[19-20]。低濃度ROS和RNS是氧化還原信號(hào)的效應(yīng)器，但積累過(guò)多以及抗氧化防御受損時(shí)，就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞功能及代謝改變[21]。谷胱甘肽（glutathione,GSH）是重要的親水性抗氧化劑，可以通過(guò)非酶反應(yīng)清除氧自由基，但GSH介導(dǎo)的過(guò)氧化氫還原需要谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的催化[22]。GSH與氧化劑作用后形成的氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione,GSSG），在依賴NADPH的GSH還原酶和硫氧還蛋白氧化還原系統(tǒng)的作用下還原為GSH。GSH/GSSG是動(dòng)物體主要的氧化-還原對(duì)之一，其比值可反映出細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化。豬前體脂肪細(xì)胞用低濃度1,25(OH)2D3處理時(shí)，細(xì)胞ROS和GSSG水平提高，GSH水平降低，導(dǎo)致GSH/GSSG比值顯著降低，反映了低濃度1,25(OH)2D3導(dǎo)致細(xì)胞氧化還原狀態(tài)向氧化態(tài)轉(zhuǎn)變；相反，高濃度1,25(OH)2D3處理，豬前體脂肪細(xì)胞ROS和GSSG水平降低，而GSH水平及GSH/GSSG比值提高，表明細(xì)胞向還原態(tài)轉(zhuǎn)變。研究表明，氧化應(yīng)激通過(guò)降低C/EBP DNA結(jié)合活性抑制3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化[23]，H2O2處理可下調(diào)PPARγ表達(dá)，降低C/EBP DNA結(jié)合活性，抑制3T3-L1細(xì)胞分化[24]。由此可見(jiàn)，1,25(OH)2D3可通過(guò)影響細(xì)胞氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)豬前體脂肪細(xì)胞分化。

超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase，SOD2）是細(xì)胞內(nèi)線粒體抵御ROS氧化損傷的重要抗氧化金屬酶，催化超氧陰離子歧化生成過(guò)氧化氫和氧，發(fā)揮抗氧化作用。過(guò)氧化物氧化還原酶（peroxredoxins，Prxs）作為線粒體抗氧化酶，在3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞活性較高，但在肥胖小鼠和人類肥胖者的脂肪組織中活性降低[25]。Prx3是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞氧化應(yīng)激和脂肪因子表達(dá)的關(guān)鍵分子，Prx3基因敲除后，3T3-L1細(xì)胞超氧化物水平升高，氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)異常[26]。提高SOD2和Prx3表達(dá)可清除過(guò)量產(chǎn)生的ROS[27-28]。在高濃度1,25(OH)2D3處理的豬脂肪細(xì)胞，SOD2和Prx3基因表達(dá)顯著提高，可能意味著細(xì)胞代謝生成的過(guò)量ROS被清除，GSH/GSSG比值提高。相比之下，低濃度1,25(OH)2D3處理對(duì)Prx3和SOD2表達(dá)均無(wú)顯著影響，細(xì)胞積累更多的ROS，GSH/GSSG降低。此外，Trx是硫氧還蛋白氧化還原系統(tǒng)的主要組成成分，Txnip通過(guò)抑制Trx的還原活性調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。1,25(OH)2D3顯著提高豬脂肪細(xì)胞Txnip基因表達(dá)[29]。本研究中，1,25(OH)2D3顯著降低豬脂肪細(xì)胞Trx mRNA表達(dá)，且高濃度1,25(OH)2D3比低濃度有更大幅度的下調(diào)，提示1,25(OH)2D3也可能通過(guò)改變Trx表達(dá)水平調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，對(duì)豬前體脂肪細(xì)胞分化產(chǎn)生影響。

4 結(jié)論

1,25(OH)2D3可通過(guò)改變細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，影響豬前體脂肪細(xì)胞分化。高濃度1,25(OH)2D3上調(diào)SOD2和Prx3表達(dá)、減少細(xì)胞ROS積累，氧化還原狀態(tài)向還原態(tài)偏移，促進(jìn)豬前體脂肪細(xì)胞分化；相反，低濃度1,25(OH)2D3處理可使細(xì)胞ROS積累增加，氧化還原狀態(tài)偏向氧化態(tài)，抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化。