汪輝

（湖北省監(jiān)利市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，監(jiān)利 433300）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種由于免疫系統(tǒng)攻擊機(jī)體正常細(xì)胞所引起的自身免疫性疾病， 患者主要表現(xiàn)出關(guān)節(jié)腫脹和疼痛， 經(jīng)常伴有關(guān)節(jié)外器官受累及血清類風(fēng)濕因子陽性， 可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失，嚴(yán)重影響患者日常生活，嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)終身殘疾的情況[1-2]。 該病好發(fā)于女性，發(fā)病率為男性的2～3 倍，可發(fā)生于任何年齡，高發(fā)年齡為40～60 歲。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的主要目的在于減輕關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，抑制病變發(fā)展及不可逆骨質(zhì)破壞，盡可能保護(hù)關(guān)節(jié)和肌肉的功能， 最終達(dá)到病情完全緩解或降低疾病活動(dòng)度的目標(biāo)。 治療原則包括患者教育、早期治療、聯(lián)合用藥、個(gè)體化治療方案以及功能鍛煉。 早期的治療就需要早期發(fā)現(xiàn)，患者患病早期比較隱匿， 一旦發(fā)病則癥狀很難通過服藥消除，所以需要早期檢查[3]。 通過相關(guān)生理指標(biāo)的檢測(cè)有助于及早發(fā)現(xiàn)及控制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展[4]。 目前在臨床上，比較認(rèn)可的指標(biāo)是白細(xì)胞抗原-DR4 (HLA-DR4)、自身抗體AC II、抗Sa 抗體。 因此，本研究擬對(duì)人類白細(xì)胞抗原-DR4(HLA-DR4)、 自身抗體AC II 和抗Sa 抗體在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷中的應(yīng)用效果進(jìn)行研究， 以期提高臨床上對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的早期診斷。 現(xiàn)將研究匯報(bào)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年3 月至2020 年3 月期間在我院風(fēng)濕科治療的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎100 例患者作為研究對(duì)象。其中男38 例，女62 例；年齡24～68 歲，平均年齡（46.35±10.56）歲。同時(shí)選取我院收治的未發(fā)生類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患者60 例，其中男22例，女38 例；年齡21～66 歲，平均年齡（45.98±10.21）歲。 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎均符合2010 版《類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)》；（2）全部患者均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重的臟器疾病；（2）妊娠期女性；（3）合并免疫系統(tǒng)疾病者；（4）入院前1 個(gè)月服用激素等藥物。 同期選取健康體檢者60例作為健康對(duì)照組，其中男23 例，女37 例；年齡22～70 歲，平均年齡（46.15±9.86）歲。三組患者的一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.0.5），具有可比性。本研究經(jīng)過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 檢測(cè)方法 （1）標(biāo)本的采集：抗體檢測(cè)采集空腹靜脈不抗凝血2.0～3.0 mL，1000 rpm 離心15 min 分離血清。 HLA-DR4 檢測(cè)采取基因組DNA，按試劑盒說明書提取DNA，取全血200 μL，加入紅細(xì)胞裂解液，振蕩混勻，離心，留有細(xì)胞核，加有核細(xì)胞裂解液，振蕩混勻至透明為止，將其加入至DNA 吸附硅膠柱上，離心，分別加入蛋白清洗液和離子清洗液進(jìn)行DNA 清洗純化， 最后使用DNA洗脫液洗脫DNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 的濃度。樣本如果不能及時(shí)檢驗(yàn)，需保持-20℃冷凍待檢，避免反復(fù)凍融。 DR 特異性引物序列為，上游：5-ACGTT TCTTGGAGCAGGTTAAACA-3；下游：5-CTGCACT GTGAAGCTCTCAC-3； 將樣本DNA、底物、Taq 酶混勻，在PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，條件為96 ℃孵育150 s，96 ℃15 s - 65 ℃60 s 共10 個(gè)循環(huán)，96 ℃15 s - 62 ℃50 s - 72 ℃35 s 共22 個(gè)循環(huán)，4 ℃保存，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行8 min 電泳，于凝膠成像系統(tǒng)上拍照，記錄結(jié)果。 （2）檢測(cè)方法： 自身抗體ACⅡ和抗Sa 抗體采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒檢測(cè)， 均采用德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份有限公司生產(chǎn)的ELISA 法試劑；HLADR4 采用美國Texas BioGene 公司的MorganTM HLA-DR4 SSP 分型試劑盒，操作均依照說明書嚴(yán)格進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 分析軟件， 計(jì)數(shù)資料組間單因素分析采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 對(duì)定量資料作受試者特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)， 計(jì)算ROC 曲線下面積，AUC 在0.5～0.7 為診斷價(jià)值較差，0.7～0.9 為診斷價(jià)值中等，＞0.9 為診斷價(jià)值較高。

2 結(jié)果

2.1 3 組人群HLA-DR4、 自身抗體ACⅡ和抗Sa抗體陽性率比較 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的HLADR4、自身抗體ACⅡ和抗Sa 抗體陽性率顯著高于非類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者及健康對(duì)照（P＜0.05）。 見表1。

表1 HLA-DR4、自身抗體ACⅡ和抗Sa 抗體陽性率比較[n（%）]

2.2 HLA-DR4、 自身抗體ACⅡ和抗Sa 抗體單項(xiàng)檢測(cè)的靈敏度和特異性 3 項(xiàng)指標(biāo)中，自身抗體ACⅡ的靈敏度（77.5%）和特異性（88.2%）最高，見表2。

表2 HLA-DR4、自身抗體ACⅡ和抗Sa 抗體單項(xiàng)檢測(cè)的靈敏度和特異性（%）

2.3 HLA-DR4、 自身抗體ACⅡ和抗Sa 抗體聯(lián)合檢測(cè)的診斷效率 3 種指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)具有的靈敏度、特異性高于單獨(dú)檢測(cè)，AUC 為0.912（P＜0.05）。見表3。

表3 HLA-DR4、自身抗體ACⅡ和抗Sa 抗體聯(lián)合檢測(cè)的診斷效率（%）

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以自身免疫為特征， 會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)滑膜增生從而引起滑膜炎甚至產(chǎn)生殘疾，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[5]。 目前，對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚未有清晰了解， 相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，生活習(xí)慣、遺傳因素、環(huán)境因素和免疫分子調(diào)節(jié)異常都是導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的危險(xiǎn)因素[6]。 對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療以早發(fā)現(xiàn)早控制為基礎(chǔ)， 早期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病情是可逆的， 但進(jìn)展到中后期則會(huì)出現(xiàn)不可逆的機(jī)體損傷，最終致殘[7]。 由于缺乏特異性的診斷指標(biāo)，使得類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的早期診斷存在較大困難。

HLA-DR4 屬于II 類主要組織相容性復(fù)合物，在抗原呈遞過程中發(fā)揮作用， 由于其抗原與部分病毒分子的表面結(jié)構(gòu)類似使得免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤識(shí)別產(chǎn)生免疫反應(yīng)[8]。 有研究表明，HLA-DR4 的等位基因?qū)︻愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病情進(jìn)展具有較高的相關(guān)性，可用于病情嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)[9]。

自身抗體二型膠原蛋白（AC II）主要由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生，因此多存在于骨骼和關(guān)節(jié)組織中，有研究報(bào)道稱，陽性AC II 是導(dǎo)致關(guān)節(jié)痛病情進(jìn)一步發(fā)展為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎并影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9]。 張平武等[10]報(bào)道AC II 與患者的風(fēng)濕因子表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)性， 可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床診斷。

Sa 抗原主要存在于人的胚胎組織和關(guān)節(jié)滑膜中，正常情況下機(jī)體并不會(huì)產(chǎn)生其對(duì)應(yīng)抗體，但有報(bào)道稱在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清中普遍存在有抗Sa 的IgG 抗體[11]。 張利軍[12]利用Sa 抗原聯(lián)合人類白細(xì)胞抗原-DR4 及抗環(huán)瓜氨酸肽抗體診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎取得較高的靈敏度和特異性。

本研究證實(shí)， 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的HLADR4、自身抗體ACⅡ和抗Sa 抗體陽性率顯著高于非類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者及健康對(duì)照（P<0.05）,而非類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者及健康對(duì)照間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 提示， 三指標(biāo)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中存在顯著高表達(dá)，可以用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床判斷。 利用三指標(biāo)單獨(dú)對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎進(jìn)行診斷發(fā)現(xiàn)，三指標(biāo)中，自身抗體ACⅡ的靈敏度和特異性最高分別為77.5%和88.2%。 為進(jìn)一步提高診斷的靈敏度和特異性， 本研究對(duì)三指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)效果進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， 任意兩項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的效果均優(yōu)于單一指標(biāo)判斷， 提示三種生物指示物的代謝通路不同,相互之間無顯著相關(guān)性。 因此，聯(lián)合檢測(cè)三種指標(biāo)具有最高的靈敏度、特異性，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，HLA-DR4、自身抗體ACⅡ和抗Sa抗體診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷準(zhǔn)確率較高， 可作為輔助診斷方式。