喻春輝，李雙，江振峰，蔡叢雯

（江西省南昌市第一醫(yī)院1.內(nèi)鏡中心；2.老年科；3.江西神州司法鑒定中心，南昌 330008）

非酒精性脂肪性肝病 (Non-alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD)已成為全球最常見的慢性肝病，全世界約25%的人群患有NAFLD，包括兒童、青少年及老年人[1-2]。 NAFLD 包括非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic Fatty Liver, NAFL)、 非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic Steatohepatitis , NASH)、非酒精性脂肪性肝纖維化及肝硬化[3]。NAFLD 早期表現(xiàn)為NAFL，其主要特征為肝脂肪變性。 隨著疾病的發(fā)展，可發(fā)生肝細胞氣球樣變性和肝小葉間炎癥。當(dāng)肝臟持續(xù)發(fā)生脂肪變性、肝臟炎癥，形成肝纖維化時，NAFLD 進入進展期，表現(xiàn)為非酒精性脂肪性肝炎和肝纖維化。 NAFLD 進入中晚期后可發(fā)生肝硬化甚至肝癌[4-6]。 流行病學(xué)和臨床研究表明，NASH 是肝硬化和肝惡性腫瘤等終末期肝病的致病因素。 肥胖、胰島素抵抗、高脂血癥及高血壓等疾病與NAFLD 疾病發(fā)生密切相關(guān)[7-8]。

NAFLD 的早期診斷缺乏特異性，導(dǎo)致NAFLD的治療仍沒有一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。 近年來，國內(nèi)外研究多集中于NAFLD 的早期干預(yù)靶點及分子機制探討。 中藥抗NAFLD 研究正受到國內(nèi)外肝病研究者的重視。 研究表明中藥丹參具有抗氧化應(yīng)激、抗細胞炎癥、抑制細胞凋亡、促進細胞再生等生物學(xué)作用[9-12]。丹參酮IIA 是丹參的脂溶性有效成分。研究發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA 具有改善急慢性肝病損傷、抗氧化應(yīng)激以及抗腫瘤作用[13-15]。 但對于丹參酮IIA抗NAFL 療效及其分子機制尚無報道。

本研究通過高脂飲食誘導(dǎo)小鼠NAFL 形成，然后給予丹參酮IIA 灌胃治療， 觀察丹參酮IIA 抗NAFL 療效，并探討內(nèi)在分子生物學(xué)機制。

1 材料和方法

1.1 NAFL 小鼠模型建立及丹參酮IIA 療程 6 周齡C57BL/6 雄性小鼠購自中國科學(xué)院上海實驗中心，飼養(yǎng)于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。 C57BL/6 小鼠隨機分為兩組， 分別為正常飲食組(Chow組，n=8)，高脂飲食組(HFD 組，n=16)。 正常飼料或高脂飼料(南通特洛菲有限公司)喂養(yǎng)8 周后，將HFD 組小鼠隨機分為兩組， 分別為HFD 組(n=8)，HFD+Tanshinone IIA 組(n=8)。HFD+Tanshinone IIA 組給予丹參酮IIA[23.1 mg/（kg·d），溶于10 mL/kg 生理鹽水][16]灌胃治療8 周。 而Chow 組及HFD 組給予生理鹽水灌胃處理8 周。16 周處死所有小鼠，采集小鼠血液及肝臟。所有動物實驗均經(jīng)南昌市第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 組織學(xué)與免疫組織化學(xué) 4%多聚甲醛及10%中性甲醛固定小鼠肝臟，分別行冰凍切片及石蠟切片。H&E 染色進行小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查。油紅O 染色檢測小鼠肝臟脂滴沉積。 天狼星紅染色檢測小鼠肝臟膠原沉積。根據(jù)NAS 評分標(biāo)準(zhǔn)[17]，對NAFL 小鼠肝臟組織病理學(xué)進行脂肪變性評分，氣球樣變評分，小葉間炎癥評分，以及NAS 總評分。利用IMAGE-PRO Plus 6.0 軟件對油紅O 染色及天狼星紅染色陽性面積百分比進行半定量。

按照標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)π∈蟾闻K石蠟切片進行免疫組織化學(xué)染色。 二甲苯脫蠟， 梯度酒精水合，3%H2O2除去內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)后，予α-SMA (ab5694, Abcam 公司)及F4/80 抗體(30325,CST 公司) 孵育，4 ℃冰箱過夜。次日給予組化二抗(GK500710, Gene Tech 公司)室溫孵育1 h。 然后用EnVision Detection Rabbit/Mouse Kit (GK500710,Gene Tech 公司)進行染色。 最后蘇木素染核，中性樹脂封閉，顯微鏡觀察并拍片。

1.3 實時熒光定量PCR 采用標(biāo)準(zhǔn)TRIzol 法(Invitrogen, Carlsbad, CA) 提取小鼠肝臟總RNA。以1 μg 總RNA 為模板，PrimeScript RT Master Mix(Takara, Tokyo, Japan)在37 ℃15 min， 85 ℃30 sec合成cDNA。 然后通過SYBR Green PCR 試劑盒(Takara, Tokyo, Japan)進行熒光定量PCR 反應(yīng)。 所用引物列于表1 中。 所有實驗重復(fù)3 次。

表1 qRT-PCR 檢測所需的引物序列

1.4 Western blot 檢測 采用蛋白Lysis buffer (pH 6.8 Tris-Hcl, 20% SDS, 100%甘油+PMSF) 提取NAFL 小鼠肝臟總蛋白。 使用BCA 蛋白測定試劑盒(Beyotime, 北京) 測定小鼠肝臟蛋白濃度。 10%SDS-PAGE 凝膠電泳肝臟蛋白樣品，然后電轉(zhuǎn)至硝基纖維素膜(NC, HAHY00010, Millipore)。 5%脫脂牛奶 (PBST 配制) 封閉NC 膜2 h， 之后予一抗4℃孵育過夜，再予驢抗鼠或驢抗兔二抗(IRDye 700 or 800, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) 室溫孵育NC 膜1 h， 最后Odyssey 成像系統(tǒng) (LICOR Biosciences) 掃膜并計算目的條帶密度值。 所使用的一抗包括：Col1A1 (BA0325, Boster, Wuhan,China),TLR4(sc-293072,Santa Cruz Biotechnology),HNF1α(89670，CST)，F(xiàn)xr(ab129089，Abcam)和GAPDH(BSAP0063, Bioworld)。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮IIA 抑制小鼠NAFL 進程 NAFL 小鼠給予丹參酮IIA 治療8 周后，實驗結(jié)果顯示，相對于HFD 組，HFD+Tanshinone IIA 組小鼠體重顯著減輕（P<0.05）。與HFD 組相比較，HFD+Tanshinone IIA 組小鼠肝重及肝重—體重比均顯著降低 （P<0.05 or P<0.01）。 肝臟HE 染色結(jié)果顯示， 丹參酮IIA 治療后顯著抑制肝臟脂肪樣變性， 降低肝臟NAS 評分（P<0.05 or P<0.001）。 與肝臟HE 結(jié)果相一致，肝臟油紅O 染色結(jié)果顯示，相對于HFD 組，HFD+Tanshinone IIA 組小鼠肝臟紅色脂滴明顯減少（P<0.01）。

2.2 丹參酮IIA 抑制NAFL 小鼠肝臟脂質(zhì)代謝 小鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因qPCR 檢測結(jié)果顯示，相對于HFD 組，HFD+Tanshinone IIA 組小鼠肝臟脂質(zhì)代謝明顯降低（P<0.05 or P<0.01）。 與HFD 組相比較，HFD+Tanshinone IIA 組小鼠肝臟膽固醇合成顯著減少（P<0.05）。 丹參酮IIA 治療后顯著降低小鼠肝臟脂肪酸吸收（P<0.05）。進一步行脂肪酸氧化基因檢測，結(jié)果顯示丹參酮IIA 治療顯著改善肝臟脂肪酸氧化反應(yīng)（P<0.05 or P<0.01）。

2.3 丹參酮IIA 改善NAFL 小鼠肝臟炎癥 行NAFL 小鼠肝臟炎癥相關(guān)檢測。 結(jié)果顯示，相對于HFD 組，HFD+Tanshinone IIA 組 小 鼠 肝 臟TLR4 mRNA 及蛋白表達水平均顯著下調(diào)，減輕小鼠肝臟炎癥反應(yīng)（P<0.05）。 炎性因子qPCR 結(jié)果顯示，與HFD 組相比較，HFD+Tanshinone IIA 組小鼠肝臟IL-6、IL-1β 以及TNFα mRNA 表達均顯著下調(diào)（P<0.05）。 F4/80 免疫組化檢測結(jié)果顯示， 相對于HFD 組，HFD+Tanshinone IIA 組 小 鼠 肝 臟F4/80蛋白表達顯著減少 （P<0.05）。 以上結(jié)果表明Tanshinone IIA 治療8 周顯著抑制NAFL 肝臟炎癥因子表達，減少單核巨噬細胞浸潤，改善肝臟炎癥。2.4 丹參酮IIA 對NAFL 小鼠肝纖維化進程無影響 行NAFL 小鼠肝纖維化相關(guān)檢測。 實驗結(jié)果表明，相對于HFD 組，HFD+Tanshinone IIA 組小鼠肝臟天狼星紅染色紅色膠原沉積無顯著降低 （P>0.05）。 進一步行小鼠肝臟α-SMA 免疫組化檢測，結(jié)果表明丹參酮IIA 對降低NAFL 小鼠肝臟α-SMA 蛋白表達作用不明顯（P>0.05）。 Western blot結(jié)果顯示，與HFD 組相比較，HFD+Tanshinone IIA組小鼠肝臟Col1A1 蛋白表達無明顯降低 （P>0.05）。 與上述結(jié)果相一致，qPCR 檢測顯示丹參酮IIA 未能明顯降低α-SMA 及Col1A1 mRNA 表達水平（P>0.05）。以上結(jié)果表明，丹參酮IIA 對NAFL小鼠肝纖維化進程無影響。

2.5 丹參酮IIA 激活NAFL 小鼠肝臟HNF1α-Fxr信號通路 HNF1α-Fxr 信號通路能夠調(diào)控肝細胞脂肪酸轉(zhuǎn)運，抑制肝臟脂肪酸結(jié)合，在肝臟脂質(zhì)代謝中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[18]。 結(jié)果顯示，相對于HFD 組，HFD+Tanshinone IIA 組小鼠肝臟HNF1α及Fxr mRNA 表達水平均顯著上調(diào) （P<0.05）。 與qPCR 結(jié)果相一致，Western blot 結(jié)果顯示，與HFD組相比較，HFD+Tanshinone IIA 組小鼠肝臟HNF1α及Fxr 蛋白表達水平均顯著增加（P<0.01）。 以上結(jié)果表明， 丹參酮IIA 可顯著激活NAFL 小鼠肝臟HNF1α-Fxr 信號通路。

3 討論

依據(jù)文獻報道[19]， 我們利用60%高脂飼料喂養(yǎng)小鼠建立小鼠NAFL 模型。 HFD 喂養(yǎng)8 周后，NAFL 組小鼠體重增加，體型圓潤，肝臟可見脂質(zhì)沉積， 無氣球樣變性及肝小葉間炎癥， 提示小鼠NAFL 模型成功建立。 再給予丹參酮IIA 灌胃治療，據(jù)文獻報道[16]，丹參酮IIA 治療劑量按小鼠體重，23.1 mg/（kg·d）, 溶于10 mL/kg 生理鹽水，灌胃，每日1 次。 丹參酮IIA 治療8 周后，相對于HFD組，HFD+Tanshinone IIA 組小鼠體重減輕， 肝重及肝重/體重比下降。丹參酮IIA 治療顯著降低NAFL小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，改善脂質(zhì)代謝及膽固醇代謝。

根據(jù)文獻報道NAS 評分標(biāo)準(zhǔn)[17]，小鼠屬于NAFL期， 尚未進展至NASH 期。 研究表明隨著NAFLD疾病進展，肝臟炎性因子表達上調(diào)，肝臟單核巨噬細胞浸潤顯著增加[20-21]。 實驗結(jié)果表明，丹參酮IIA可顯著下調(diào)IL-6 及TNFα mRNA 表達水平， 抑制F4/80 蛋白表達，改善NAFL 小鼠肝臟炎癥。 進一步行肝臟肝纖維化相關(guān)指標(biāo)檢測， 結(jié)果顯示丹參酮IIA 對NAFL 小鼠肝纖維化進程無顯著影響。因此，我們的結(jié)果表明丹參酮IIA 可改善NAFL 小鼠肝臟脂肪變性，減輕肝臟炎癥浸潤，而對肝臟纖維化進程無影響。

研究表明，HNF1α 可以調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝。肝臟HNF1α 蛋白異常表達可抑制肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白的功能，破壞肝細胞中脂肪酸的轉(zhuǎn)運功能，導(dǎo)致肝細胞脂質(zhì)沉積[18]。 HNF1α 全身小鼠表現(xiàn)為肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白表達顯著下調(diào)， 肝臟脂質(zhì)沉積，小鼠NAFLD 形成[22]。HNF1α 可以直接與肝臟Fxr 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)Fxr 轉(zhuǎn)錄表達，影響肝臟脂質(zhì)代謝及膽固醇代謝[23]。 肝臟HNF1α-Fxr 信號通路在肝臟炎癥及脂質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用。 小鼠體內(nèi)實驗證實，激活HNF1α-Fxr 信號通路可調(diào)節(jié)肝臟膽汁酸代謝， 抑制膽固醇結(jié)石形成[24]。HNF1α-Fxr 信號通路激活可以抑制肝臟TNFα 和IL-6 的表達水平，減輕膽汁淤積性肝損傷[25]。 研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮IIA 治療后可顯著上調(diào)肝臟HNF1α-Fxr mRNA 及蛋白表達水平，激活肝臟HNF1α-Fxr信號通路。

綜上所述，丹參酮IIA 可通過激活NAFL 小鼠肝臟HNF1α-Fxr 信號通路， 從而抑制小鼠NAFL進程，改善NAFL 小鼠肝臟炎癥，以及抑制肝臟脂質(zhì)代謝。為臨床上丹參酮IIA 治療NAFL 病人提供理論依據(jù)。