劉 宇，葉 泰，曹 慧，袁 敏，于勁松，徐 斐，朱佳怡，祁 泓，陳佳宇

（上海食品快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093）

擬除蟲菊酯是一類常用的殺蟲劑，其結(jié)構(gòu)類似于在菊花中發(fā)現(xiàn)的天然除蟲菊酯，但具有更高的殺蟲效力和環(huán)境穩(wěn)定性［1］。擬除蟲菊酯農(nóng)藥含有酯鍵，可以通過(guò)裂解、水解和不可逆抑制等方式破壞酯鍵進(jìn)行降解［2］。有報(bào)道稱羧酸酯酶能夠水解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥［3］，酯酶的催化機(jī)制取決于特定的催化三聯(lián)體，該三聯(lián)體由酯酶活性位點(diǎn)內(nèi)的3 個(gè)氨基酸殘基（絲氨酸、組氨酸和谷氨酰胺或天冬氨酸）組成［4］。然而，高溫、極端pH 值和有機(jī)溶劑等環(huán)境均會(huì)嚴(yán)重影響酶的催化活力和穩(wěn)定性［5-6］。因此，通過(guò)酶的固定化策略提高游離酶的表觀活力及環(huán)境耐受性受到越來(lái)越多的關(guān)注［7］。但通過(guò)共價(jià)結(jié)合、吸附、包埋和交聯(lián)等方法制備得到的固定化酶［8］存在固定方法繁瑣、催化反應(yīng)過(guò)程傳質(zhì)速率較差，以及由于固定過(guò)程中酶活性位點(diǎn)被封閉或酶構(gòu)象發(fā)生變化而導(dǎo)致其活性喪失等缺點(diǎn)［9-10］。因此，迫切需要開發(fā)具有高催化活性和環(huán)境耐受性的酶固定化策略。

近年來(lái)，通過(guò)金屬離子磷酸鹽與蛋白質(zhì)間的自組裝作用形成的有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化納米花材料被廣泛用于固定化酶的制備［11-12］。與傳統(tǒng)制備方式相比，該方法制備條件溫和，且雜化“納米花”材料固有的大比表面積可有效降低傳質(zhì)阻力，制備得到的“納米花”酶具有較好的酶活和化學(xué)穩(wěn)定性［13-14］。前期工作中，本小組采用生物礦化策略制備了鈣離子豬肝酯酶雜化“納米花”酶（Ca3（PO4）2-PLE），并將其用于擬除蟲菊酯農(nóng)藥的水解實(shí)驗(yàn)［15］，但酶活僅為游離酶的169%，且制備的納米花酶循環(huán)使用6次后，殘余酶活僅為初始值的10%。有研究表明，多級(jí)層狀結(jié)構(gòu)自身的柔性會(huì)導(dǎo)致制備得到的蛋白-金屬雜化納米花酶在離心純化過(guò)程中易被破壞，造成酶活力降低［16-17］。因此，進(jìn)一步提高納米花酶的機(jī)械強(qiáng)度有利于改善其貯存穩(wěn)定性以及可重復(fù)利用性［18-19］。

本文在生物礦化策略的基礎(chǔ)上，引入戊二醛作為交聯(lián)劑，制備了交聯(lián)型豬肝酯酶雜化“納米花”酶（CL-PLE-NFs）。通過(guò)戊二醛交聯(lián)，有效改善了納米花酶的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性、有機(jī)試劑耐受性以及可重復(fù)利用性。在優(yōu)化交聯(lián)雜化“納米花”制備條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了其催化活性及短時(shí)間內(nèi)對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的水解性能，為構(gòu)建基于酶水解法的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法提供了新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters 1525 高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；Sepax HP-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)賽分公司）；Inspect F50掃描電子顯微鏡（美國(guó)FEI公司）；JEM-2100高分辨透射電鏡（日本電子株式會(huì)社）；JiS5 傅里葉紅外掃描儀（美國(guó)Nicolet 公司）；MD200-2 氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）；恒溫混勻儀（杭州米歐儀器有限公司）。

豬肝酯酶（PLE）、戊二醛（Sigma-Aldrich 公司）；溴氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氰戊菊酯、S-氰戊菊酯、高效氟氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、氟胺氰菊酯、高效氯氰菊酯、甲氰菊酯等菊酯類農(nóng)藥（上海農(nóng)藥研究所）；磷酸鹽緩沖液（PBS，1X，pH 7.4）；考馬斯亮藍(lán)G-250（生物級(jí)，生物工程上海股份有限公司）；七水合硫酸鈷（CoSO4·7H2O）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙酸-1-萘酯、固蘭B及其他試劑（上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）。所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

1.2 CL-PLE-NFs的合成與交聯(lián)

在6 mL 含0.25 mg/mL 豬肝脂酶的PBS（1X，pH 7.4）中，加入40 μL、500 mmol/L 的CoSO4·7H2O，反應(yīng)過(guò)夜，然后加入20 μL、50 mmol/L 的戊二醛溶液，反應(yīng)4 h 后，離心去除上清液，用超純水水洗3次除去雜質(zhì)，入0.6 mL 磷酸鹽緩沖溶液（5 mmol/L，pH 8.4）混勻，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酶活及包封率的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)方法進(jìn)行改進(jìn)［20-21］：將豬肝酯酶和雜化“納米花”以超純水適當(dāng)稀釋備用，試管中先加入2 mL pH 6.4 的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，再加入0.5 mL 稀釋后的酶液，最后加入50 μL 底物（125 mmol/L的乙酸-1-萘酯丙酮溶液）混合均勻，在30 ℃水浴反應(yīng)5 min后，加入0.5 mL顯色劑（0.4%固蘭B的1.8%SDS溶液）混合均勻，再于30 ℃水浴反應(yīng)5 min。以不加底物的反應(yīng)液作空白，測(cè)定595 nm處的吸光度。1 U的定義為每分鐘能水解10-6mol乙酸-1-萘酯的酶量。根據(jù)式（1）計(jì)算初始總酯酶活力：

其中，D為酶液的稀釋倍數(shù)；A595為反應(yīng)液在595 nm 處的吸光度（OD）；K為對(duì)應(yīng)pH 值條件下乙酸-1-萘酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（10-6mol/OD）；V為酶液總體積（mL）。

利用考馬斯亮藍(lán)法［22］對(duì)豬肝酯酶雜化“納米花”的實(shí)際蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。雜化“納米花”中蛋白質(zhì)含量與初始加入的豬肝酯酶蛋白質(zhì)含量之比即為包封率（EY）：

其中，m為雜化納米花中豬肝酯酶的質(zhì)量（mg）；M為初始加入到溶液中的豬肝酯酶的質(zhì)量（mg）。

1.4 CL-PLE-NFs的酶促動(dòng)力學(xué)曲線［23］

將2 mL pH 6.4的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液與0.5 mL豬肝酯酶置于10 mL試管中，加入50 μL不同濃度的底物，混勻后30 ℃水浴反應(yīng)5 min。然后加入0.5 mL顯色劑，再于30 ℃水浴反應(yīng)5 min。以不加底物的反應(yīng)液作空白，測(cè)定595 nm 處的吸光度。雜化“納米花”的測(cè)定方法同上。根據(jù)米氏方程（3），計(jì)算米氏常數(shù)Km（mol/L）和最大反應(yīng)速度Vmax（mol·s-1·mg-1）。

其中，V為初始反應(yīng)速度（mol·s-1·mg-1）；［S］為底物濃度（mol/L）。

1.5 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥水解性能的研究

取“1.2”制得的雜化“納米花”溶液于玻璃管中（酶活力為44 742 U），分別加入200 μL、10 μg/mL 的11種菊酯農(nóng)藥，于45 ℃以800 r/min 振蕩反應(yīng)5 min進(jìn)行水解，再用高效液相色譜檢測(cè)剩余農(nóng)藥濃度。高效液相色譜分析：將5 mL乙腈和1 g NaCl加入到上述酶解反應(yīng)液，于25 ℃下以1 200 r/min振蕩10 min，靜置分層后，取4 mL 上清液40 ℃氮吹至干，然后加入200 μL 乙腈復(fù)溶，用高效液相色譜檢測(cè)。

液相色譜條件：色譜柱為Sepax HP-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A 為乙腈，B 為超純水，A 相∶B 相= 78∶22（體積比）；流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫25 ℃。農(nóng)藥水解率的計(jì)算公式如下：

式中，c0、c1分別為水解前、后菊酯類農(nóng)藥的質(zhì)量濃度（μg/mL）。

2 結(jié)果與討論

2.1 CL-PLE-NFs的制備條件優(yōu)化

CL-PLE-NFs 的合成過(guò)程如圖1 所示。不同的合成條件會(huì)對(duì)CL-PLE-NFs 的蛋白包封率和酶活力產(chǎn)生不同的影響，這主要與制備過(guò)程中酶的穩(wěn)定性有關(guān)［24］。分別對(duì)豬肝酯酶的質(zhì)量濃度以及交聯(lián)劑戊二醛的濃度進(jìn)行優(yōu)化，并以相對(duì)酶活為指標(biāo)，篩選出最優(yōu)的制備條件。圖2A 為不同質(zhì)量濃度PLE 對(duì)交聯(lián)雜化“納米花”酶活的影響。當(dāng)加入酶的質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL 時(shí)，酶活最高，為游離PLE 的195%，之后隨著酶質(zhì)量濃度的增加，相對(duì)酶活逐漸下降。這可能是因?yàn)槿芤褐蠧o2+和PLE 的成核位點(diǎn)所能固定的酶量一定，不會(huì)隨著酶質(zhì)量濃度的增加而增加。Wang 等［25］的研究表明，酶的質(zhì)量濃度會(huì)對(duì)交聯(lián)雜化“納米花”的形態(tài)造成影響，當(dāng)酶質(zhì)量濃度從0.2 mg/mL 增加至2 mg/mL 時(shí)，所形成的固定化酶逐漸從花狀結(jié)構(gòu)變成平行六面體，且酶活隨之降低。因此，選擇豬肝酯酶的質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL。

圖1 CL-PLE-NFs的制備Fig.1 The schematic of CL-PLE-NFs synthesis

如圖2B 所示，隨著戊二醛濃度的增加，酶活呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)戊二醛的濃度為0.05 mol/L 時(shí)，酶活達(dá)到最高值，為游離PLE的224%。隨著戊二醛濃度的進(jìn)一步增加，酶活有所降低。這可能是因?yàn)槲於┑臐舛容^低時(shí)，所能結(jié)合的蛋白質(zhì)分子較少，表現(xiàn)為較低的酶活。但隨著戊二醛濃度的增加，固定的PLE 越來(lái)越多，過(guò)多的酶會(huì)堵塞載體孔道，使酶的活性位點(diǎn)相互遮蓋，導(dǎo)致酶活性降低。因此，選擇0.05 mol/L作為戊二醛的最適濃度。

圖2 豬肝酯酶質(zhì)量濃度（A）與戊二醛濃度（B）對(duì)CL-PLE-NFs酶活力的影響Fig.2 Effects of porcine liver esterase mass concentration（A）and glutaraldehyde concentration（B）on the enzyme activity of CL-PLE-NFs

2.2 CL-PLE-NFs的紅外光譜

為了證明游離PLE 已經(jīng)成功負(fù)載，對(duì)CL-PLENFs 和游離PLE 進(jìn)行紅外光譜（FT-IR）分析。結(jié)果如圖3 所示，575 cm-1和614 cm-1處為磷酸基團(tuán)的面內(nèi)彎曲振動(dòng)；992 cm-1和1 078 cm-1處是P—O 和P===== O 的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，表明存在磷酸基團(tuán)；從圖中還可以發(fā)現(xiàn)1 620 cm-1和1 655 cm-1處存在明顯的N—H 彎曲振動(dòng)，表明雜化“納米花”中存在氨基，證明了蛋白質(zhì)的存在。這些結(jié)果均說(shuō)明CL-PLE-NFs成功制備。

圖3 PLE和CL-PLE-NFs的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of PLE and CL-PLE-NFs

2.3 CL-PLE-NFs的酶活力與動(dòng)力學(xué)研究

在最優(yōu)的制備條件下，對(duì)游離PLE 和CL-PLENFs 的酶活進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算，得到游離PLE 的酶活為5 712 U/mg；CL-PLE-NFs 的酶活為13 232 U/mg，包封率為45.18%。與游離酶相比，CL-PLE-NFs 的酶活提高了231%。說(shuō)明Co2+和組氨酸的配位結(jié)合選擇性地驅(qū)動(dòng)了礦化和戊二醛的交聯(lián)作用，有助于“納米花”的合成，并可以提高酶活力。進(jìn)一步評(píng)估了CL-PLENFs 的催化活性，通過(guò)測(cè)定不同底物濃度下PLE 和CL-PLE-NFs 的酶活，對(duì)初始反應(yīng)速率進(jìn)行非線性曲線擬合，計(jì)算PLE 和CL-PLE-NFs 的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax。從圖4可以看出，CL-PLE-NFs的Km值約為游離PLE的150%，可能是因?yàn)榻宦?lián)劑戊二醛的加入增加了傳質(zhì)阻力，造成納米花酶與底物的親和力降低。另外，由圖4 插圖可知，CL-PLE-NFs 的Vmax為游離酶的134%，可能是因?yàn)榧{米花的比表面積大，增加了底物與活性位點(diǎn)碰撞的可能性。

圖4 PLE和CL-PLE-NFs的米氏曲線Fig.4 Michaelis curves of PLE and CL-PLE-NFs

2.4 CL-PLE-NFs的穩(wěn)定性分析

對(duì)CL-PLE-NFs 的pH 值（5.0 ～9.0）穩(wěn)定性和溫度（20 ～60 ℃）穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。圖5A 為游離PLE和CL-PLE-NFs的pH值穩(wěn)定性結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)在不同pH值下放置30 min之后，兩種酶均可以保留64%以上的酶活，而且pH 值越高，酶活損失越少，說(shuō)明堿性環(huán)境有利于酶的水解作用。除此之外，還發(fā)現(xiàn)CL-PLE-NFs在不同pH值條件下殘余的酶活力均高于游離PLE，具有更好的pH值穩(wěn)定性。從圖5B可以看出，CL-PLE-NFs在40 ℃之前比較穩(wěn)定，50 ℃時(shí)仍保留有65%的活性，而游離PLE 在大于30 ℃之后迅速失活。結(jié)果說(shuō)明CL-PLE-NFs 具有良好的溫度穩(wěn)定性，這可能是因?yàn)镃L-PLENFs的片層狀花瓣結(jié)構(gòu)對(duì)PLE具有保護(hù)作用，可以使其在實(shí)際應(yīng)用中使用的溫度范圍更廣。

圖5 pH值（A）、溫度（B）對(duì)PLE和CL-PLE-NFs相對(duì)酶活的影響，以及4 ℃（C）、25 ℃（D）時(shí)PLE和CL-PLE-NFs的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性Fig.5 The effects of pH value（A）and temperature（B）on the relative activity of PLE and CL-PLE-NFs，and the storage stability of PLE and CL-PLE-NFs at 4 ℃（C）and 25 ℃（D）

從圖5C可以發(fā)現(xiàn)，CL-PLE-NFs在4 ℃下儲(chǔ)藏320 d仍能保留70.85%的活性，而游離PLE 的酶活呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，在20 d 之后，酶活已經(jīng)不足80%，當(dāng)儲(chǔ)藏時(shí)間到達(dá)92 d 時(shí)，游離PLE 的酶活損失一半。圖5D 也呈現(xiàn)類似的現(xiàn)象，CL-PLE-NFs 在25 ℃條件下儲(chǔ)藏171 d 后依然能夠保留59%以上的活性，且其穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于游離PLE。游離PLE 的酶活在儲(chǔ)藏7 d后即開始急速下降；經(jīng)過(guò)31 d后，酶活已不足20%；隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，當(dāng)儲(chǔ)藏時(shí)間達(dá)到92 d 時(shí)，游離PLE的酶活只有初始酶活的5%。表明經(jīng)過(guò)交聯(lián)雜化的PLE 的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性遠(yuǎn)優(yōu)于游離PLE。

2.5 CL-PLE-NFs的有機(jī)試劑耐受性

考察了CL-PLE-NFs對(duì)15%的甲醇、乙腈、乙醇、丙酮的耐受性。結(jié)果如圖6所示，在分別含有上述4種常用有機(jī)試劑的環(huán)境中，CL-PLE-NFs的相對(duì)酶活分別為游離酶的4.5、1.75、2.4和5倍，表明CL-PLE-NFs對(duì)于有機(jī)試劑有著更好的耐受性。

圖6 4種有機(jī)試劑對(duì)PLE和CL-PLE-NFs酶活力的影響Fig.6 The effects of four kinds of organic solvent on the activity of PLE and CL-PLE-NFs

2.6 CL-PLE-NFs對(duì)不同擬除蟲菊酯類農(nóng)藥水解性能的研究

CL-PLE-NFs 在5 min 內(nèi)對(duì)11 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的水解結(jié)果如圖7 所示，其對(duì)Ⅰ型和Ⅱ型菊酯類農(nóng)藥的水解率均在55%以上，說(shuō)明合成的CL-PLE-NFs 對(duì)菊酯類農(nóng)藥具有良好的水解性能。對(duì)于不同的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，CL-PLE-NFs 的水解效率不同。這可能是因?yàn)檗r(nóng)藥分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)存在差異。對(duì)于Ⅱ型菊酯類農(nóng)藥，氯氰菊酯的水解效果最好，水解率達(dá)93.91%；對(duì)Ⅰ型菊酯類農(nóng)藥聯(lián)苯菊酯的水解率達(dá)到了62.12%。

圖7 CL-PLE-NFs對(duì)不同擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的水解率Fig.7 Hydrolysis rates of different pyrethroids by CL-PLE-NFs

2.7 CL-PLE-NFs的可重復(fù)利用性

為了驗(yàn)證CL-PLE-NFs 的可重復(fù)利用性，選取溴氰菊酯為對(duì)象進(jìn)行循環(huán)水解實(shí)驗(yàn)，考察了不同重復(fù)利用次數(shù)條件下，CL-PLE-NFs對(duì)溴氰菊酯的水解性能。結(jié)果如圖8 所示，CL-PLE-NFs 在循環(huán)使用8 次后仍保持80.52%的水解效率。隨著循環(huán)次數(shù)的增加，CL-PLENFs 對(duì)于溴氰菊酯的水解率逐漸降低。經(jīng)過(guò)12 次循環(huán)反應(yīng)后，CL-PLE-NFs 對(duì)溴氰菊酯仍保持65.37%的水解率。以上結(jié)果表明，交聯(lián)型雜化納米花酶具有優(yōu)異的重復(fù)利用性。

圖8 CL-PLE-NFs在擬除蟲菊酯農(nóng)藥水解實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的可重復(fù)利用性Fig.8 Reusability of CL-PLE-NFs in pyrethroid pesticide hydrolysis experiment

3 結(jié) 論

本文制備了CL-PLE-NFs，其表觀酶活為游離酶的231%，在4 ℃條件下貯藏320 d 后，仍能保留70.85%的酶活力；此外，該酶對(duì)Ⅰ型和Ⅱ型的菊酯類農(nóng)藥均有較好的水解能力，在5 min 內(nèi)對(duì)11 種擬除蟲菊酯農(nóng)藥的水解率均達(dá)55%以上。且循環(huán)使用12 次后，對(duì)溴氰菊酯農(nóng)藥的水解效率仍達(dá)65.37%。CLPLE-NFs有望用于酶法擬除蟲菊酯農(nóng)藥快速檢測(cè)試劑盒的開發(fā)與應(yīng)用。