余秋玲，張永梅，邱 月，秦 瑤，龍 梅

（重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，重慶 401123）

膠塞是藥品包裝材料中重要的密封組件，具有彈性好、抗腐蝕性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，通常需加入抗氧劑以抑制或延緩其氧化［1］。藥用膠塞主要用于西林瓶、預(yù)灌封注射器、筆帽式注射器等［2-3］。絕大多數(shù)情況下，藥品與膠塞直接接觸，膠塞中的抗氧劑會(huì)遷移至藥品中［4］，從而對(duì)患者的身體健康構(gòu)成威脅?！痘瘜W(xué)藥品與彈性體密封件相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》［5］明確指出，熱塑性彈性體在共混時(shí)一般會(huì)加入抗氧劑，須在相容性實(shí)驗(yàn)中予以重點(diǎn)關(guān)注。因此，建立藥用膠塞中多種抗氧劑的檢測(cè)方法十分必要。

目前抗氧劑的檢測(cè)方法主要有液相色譜法［6-7］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［8］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［9-10］和超臨界流體色譜法［11］等。其中，液相色譜法應(yīng)用范圍最廣，但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、檢出限較高；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法無(wú)法對(duì)高沸點(diǎn)抗氧劑（如抗氧劑168 等）進(jìn)行分析，適用范圍窄；超臨界流體色譜法對(duì)儀器硬件要求較高，限制了其廣泛應(yīng)用［12］。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS）集質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度和液相色譜的高分離能力于一體，在現(xiàn)代分析領(lǐng)域中具有廣泛應(yīng)用。胡佩等［13］采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)藥品包裝中9 種抗氧劑，但分析時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30 min；董犇等［14］采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時(shí)檢測(cè)食品接觸材料及制品中9種抗氧劑，分析時(shí)間約8 min，但其方法檢出限為0.1 mg/L，靈敏度相對(duì)較低。程暢等［15］采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食品接觸橡膠密封墊圈中7 種抗氧劑，分析時(shí)間約15 min。綜上，目前報(bào)道的檢測(cè)抗氧劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法普遍存在能同時(shí)檢測(cè)的抗氧劑種類(lèi)少、靈敏度較低或分析效率低等問(wèn)題。

本研究基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)建立了藥用膠塞中12種抗氧劑的檢測(cè)方法。該方法前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，定性定量準(zhǔn)確，可在6 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)12 種抗氧劑的同時(shí)檢測(cè)，為藥品與包材相容性實(shí)驗(yàn)中抗氧劑的快速篩查提供了技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX 公司）；SQP 型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信試驗(yàn)儀器有限公司）；Lab Dancer渦旋混合儀（德國(guó)IKA公司）。

抗氧劑1024（99.6%）、抗氧劑1035（98.0%）、抗氧劑1222（97.5%）、抗氧劑1425（98.4%）、抗氧劑300（95.0%）、抗氧劑702（98.7%）、抗氧劑BBM（99.8%）、抗氧劑168（99.8%）均購(gòu)于廣州佳途科技有限公司；抗氧劑3114（99.9%）購(gòu)于美國(guó)Accustandard 公司；抗氧劑BHT-COOH（98%）購(gòu)于河北百靈威超精細(xì)材料有限公司；抗氧劑1310（99.4%）、抗氧劑330（99.5%）均購(gòu)于北京曼哈格生物科技有限公司。以上12種抗氧劑的化學(xué)文摘登記號(hào)（CAS）、分子式和分子量等信息見(jiàn)表1。乙腈、甲醇、甲酸（均為質(zhì)譜級(jí)）購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲酸銨（質(zhì)譜級(jí)）購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；乙醇（色譜純）購(gòu)于Fisher Chemical 公司；二氯甲烷（色譜純）購(gòu)于霍尼韋爾貿(mào)易有限公司；氯化鈉（分析純）購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；0.22 μm聚四氟乙烯（PTFE）針式濾膜購(gòu)于日本島津公司。

表1 12種抗氧劑的簡(jiǎn)稱(chēng)、化學(xué)文摘登記號(hào)、分子式和分子量Table 1 Synonyms，CAS，molecular formulas and molecular weights of 12 antioxidants

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)品25 mg（精確至0.1 mg），置于50 mL容量瓶中，加適量二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確移取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋成抗氧劑BBM 和抗氧劑1310 的質(zhì)量濃度為5 000 ng/mL，抗氧劑168 為4 000 ng/mL，抗氧劑3114 為2 000 ng/mL，其余各物質(zhì)的質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL 的中間液。再用乙腈將上述中間液稀釋成抗氧劑BBM 和抗氧劑1310的質(zhì)量濃度分別為25、50、100、250、375、500 ng/mL，抗氧劑168 分別為20、40、80、200、300、400 ng/mL，抗氧劑3114 分別為10、20、40、100、150、200 ng/mL，其余各物質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、75、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

將藥用膠塞剪成小碎片（單個(gè)質(zhì)量≤0.2 g），稱(chēng)取20 g（精確至0.1 mg）置于帶蓋試劑瓶中，加入20%乙醇溶液100 mL，在60 ℃條件下浸泡72 h，冷卻至室溫，過(guò)濾即得膠塞的提取液。準(zhǔn)確移取2.0 mL 提取液于10 mL 比色管中，再加入2.0 mL 乙腈，渦旋搖勻，加入1.0 g 氯化鈉，充分渦旋振蕩萃取，靜置分層，取上層清液過(guò)0.22 μm PTFE濾膜，取續(xù)濾液上機(jī)測(cè)定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：Hypersil Gold C8（100 mm × 2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：A 為0.02%甲酸和5 mmol/L 甲酸銨水溶液，B 為甲醇；柱溫為45 ℃；進(jìn)樣體積為3 μL；流速為0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～0.2 min，70% B；0.2～2 min，70%～98% B；2～6 min，98% B；6～6.5 min，98%～70% B；6.5～7.5 min，70%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；離子模式：正、負(fù)離子模式；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；氣簾氣：206.8 kPa；離子源溫度：500 ℃；噴霧氣和輔助加熱氣：344.7 kPa。12種目標(biāo)化合物的母離子、子離子、碰撞能、離子模式和保留時(shí)間見(jiàn)表2。

表2 12種抗氧劑的母離子、子離子、去簇電壓、碰撞能量、離子模式和保留時(shí)間Table 2 Parent ions，daughter ions，declustering potentials，collision energies，polarities and retention times of 12 antioxidants

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

分別考察了XSelect HSS T3（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）、ZORBAX Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm，1.9 μm）和Hypersil Gold C8（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）3種色譜柱對(duì)12種抗氧劑分離效果的影響。結(jié)果表明，使用XSelect HSS T3色譜柱時(shí)，極性較弱的抗氧劑330和抗氧劑168不出峰；使用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱時(shí)，抗氧劑168 有色譜柱殘留；使用Hypersil Gold C8色譜柱時(shí)，12種抗氧劑均能正常出峰，分離效果較好且無(wú)色譜柱殘留。原因可能是XSelect HSS T3 和ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱對(duì)弱極性化合物的保留較強(qiáng)，導(dǎo)致弱極性化合物難以被洗脫下來(lái)，而Hypersil Gold C8色譜柱固定相的碳鏈更短，對(duì)弱極性化合物的保留較弱，使其更容易被洗脫下來(lái)，從而避免色譜柱殘留。因此選擇Hypersil Gold C8色譜柱進(jìn)行分離，12 種抗氧劑（質(zhì)量濃度約為100～500 ng/mL）在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖（TIC）見(jiàn)圖1。由圖可知，12種抗氧劑在6 min內(nèi)得到有效分離。

圖1 12種抗氧劑在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of 12 antioxidants the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

流動(dòng)相是影響色譜峰峰形、分離度及峰面積的重要因素。由于抗氧劑BBM 的母離子為加氨離子，為最大程度提高其響應(yīng)強(qiáng)度，在水相中加入5 mmol/L 甲酸銨；此外，為改善抗氧劑1310的峰形，將流動(dòng)相調(diào)至酸性［7］，考察了甲酸體積分?jǐn)?shù)在0～0.08%范圍內(nèi)對(duì)抗氧劑1310 峰形和抗氧劑BBM 峰面積的影響（圖2）。結(jié)果表明，不加入甲酸時(shí)，抗氧劑1310 的峰形展寬；隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)的增大，抗氧劑BBM 的響應(yīng)強(qiáng)度逐漸減小，因此選擇甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.02%。最終選擇0.02%甲酸和5 mmol/L 甲酸銨水溶液作為水相，甲醇作為有機(jī)相。

圖2 甲酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)抗氧劑1310峰形（A）和抗氧劑BBM峰面積（B）的影響Fig.2 Effects of formic acid volume fraction on the peak shape of antioxidant 1310（A）and the peak area of antioxidant BBM（B）

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式，分別在ESI＋、ESI-模式下對(duì)12 種抗氧劑的單標(biāo)溶液（質(zhì)量濃度約為500 ng/mL）進(jìn)行全掃描確定母離子；然后根據(jù)母離子分別對(duì)其子離子進(jìn)行掃描，選取豐度最大的2 個(gè)子離子，以豐度較大的為定量離子，另一個(gè)則為定性離子；最后進(jìn)行去簇電壓和碰撞能的優(yōu)化。12種抗氧劑的最佳質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

2.4 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

按照“1.2”配制12 種抗氧劑的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在最優(yōu)條件下上機(jī)測(cè)定，以各抗氧劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/L），對(duì)應(yīng)的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，建立線性方程。選取陰性藥用膠塞樣品進(jìn)行加標(biāo)，按照“1.3”進(jìn)行前處理后上機(jī)測(cè)定，分別以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）確定各抗氧劑的方法檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。結(jié)果顯示，12種抗氧劑在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.995，LOD、LOQ 分別為0.10～25 ng/g和0.25～75 ng/g（見(jiàn)表3）。

表3 12種抗氧劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量下限Table 3 Linear equations，correlation coefficients，linear ranges，LODs and LOQs of 12 antioxidants

2.5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

選取陰性藥用膠塞樣品分別進(jìn)行3 個(gè)濃度水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn)。由表4 可知，12 種抗氧劑的平均加標(biāo)回收率為75.6%～117%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.90%～8.4%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度與精密度，能夠滿足實(shí)際檢測(cè)要求。

表4 12種抗氧劑的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of 12 antioxidants（n=6）

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)10 種市售藥用膠塞中的目標(biāo)抗氧劑進(jìn)行篩查，結(jié)果表明，抗氧劑1310 和抗氧劑BHT-COOH 有檢出，其余抗氧劑均未檢出。其中，9 種藥用膠塞中檢出抗氧劑1310，檢出量為1.0～5.0 mg/kg；3種藥用膠塞中檢出抗氧劑BHT-COOH，檢出量為0.02～0.09 mg/kg。若藥品采用上述陽(yáng)性膠塞作為包裝材料，則膠塞中抗氧劑1310 或抗氧劑BHT-COOH 存在向藥品中遷移的風(fēng)險(xiǎn)，需在后續(xù)的遷移實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

3 結(jié) 論

本文通過(guò)對(duì)色譜柱、流動(dòng)相和質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速篩查藥用膠塞中12種抗氧劑的分析方法。本方法前處理簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，定性定量準(zhǔn)確，為保證藥品包裝材料的安全使用提供了技術(shù)手段。