岑建斌，周朗君，方厚托，林茵茵，區(qū)碩俊，黨 華，何敏恒，黃嘉樂，李秀英

（廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司，國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣東），廣東 廣州 511447）

對(duì)羥基苯甲酸酯（Parabens），又稱尼泊金酯，因其具有酚羥基結(jié)構(gòu)，屬酚類防腐劑，其作用機(jī)制是破壞微生物的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性，并可抑制微生物細(xì)胞的呼吸酶系與電子傳遞酶系的活性，具有良好的抑菌作用，是一種廣譜型抗菌防腐劑［1］。對(duì)羥基苯甲酸酯的烷基碳鏈越長(zhǎng)，菌體對(duì)尼泊金酯的吸附量越大，因而抗菌活性也越大［2］。有研究表明，對(duì)羥基苯甲酸酯具有雌激素活性［3-5］，在人體中，從胃腸道和血液中迅速吸收，水解為對(duì)羥基苯甲酸，偶聯(lián)并從尿液中排出［6］。接觸對(duì)羥基苯甲酸酯可干擾人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)［7］，且對(duì)人體細(xì)胞有一定毒性［8］，從而對(duì)人類健康產(chǎn)生有害后果。我國(guó)允許部分該類物質(zhì)（對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯）作為防腐劑在食品和藥品的生產(chǎn)過程中使用［6］。其中GB 2760-2014 對(duì)經(jīng)表面處理的鮮水果中的對(duì)羥基苯甲酸酯類（甲酯、乙酯）及其鈉鹽做出明確限量，要求以對(duì)羥基苯甲酸計(jì)不得大于0.012 g/kg［9］。而國(guó)際上歐洲經(jīng)濟(jì)共同體（EEC）規(guī)定，以對(duì)羥基苯甲酸計(jì)，食品中對(duì)羥基苯甲酸酯的最高允許含量為0.1%；當(dāng)幾種對(duì)羥基苯甲酸酯復(fù)配使用時(shí)，其總量不得超過0.1%［10］。因此，有必要對(duì)除甲酯、乙酯外的對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)進(jìn)行定量研究。

目前測(cè)定對(duì)羥基苯甲酸酯的方法主要有液相色譜法［10-13］、薄層色譜法［14］、毛細(xì)管電泳法［15］、氣相色譜法［16-18］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［19-20］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［21-22］、合相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［23］等。其中，液相色譜法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法具有前處理步驟繁瑣，分析圖譜易受到雜質(zhì)的影響，以及方法靈敏度較低的特點(diǎn)，對(duì)于ppb 級(jí)的目標(biāo)化合物，難以準(zhǔn)確測(cè)定，易出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)目標(biāo)物具有更高的選擇性，靈敏度較高，且分析圖譜受雜質(zhì)的影響較小，對(duì)于同時(shí)測(cè)定多種化合物，具有高效定性定量的優(yōu)點(diǎn)，且前處理無需過多凈化或衍生即可準(zhǔn)確測(cè)定，分析時(shí)間較短。近年來，相較于上述分析方法，高分辨質(zhì)譜（HRMS）由于能測(cè)定精確質(zhì)量數(shù)，因此具有更強(qiáng)的定性能力，在食品殘留及污染物的快速檢測(cè)和篩查中得到一定的應(yīng)用［24-26］。本文以不同水果和17種對(duì)羥基苯甲酸酯為研究對(duì)象，借助超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-Orbitrap HRMS），建立了快速測(cè)定不同水果中17 種對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Vanquish UHPLC 超高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；Thermo Q-Exactive Orbitrap 高分辨質(zhì)譜儀，配有電噴霧（H-ESI）離子源（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；KDC-40 低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；IKA MS3 混勻振蕩器（德國(guó)IKA 公司）；ML204T 電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

3，5-二氯對(duì)羥基苯甲酸甲酯（純度97%）、對(duì)羥基苯甲酸癸酯（純度95%），上海源葉生物科技有限公司；對(duì)羥基苯甲酸甲酯（純度99.7%）、對(duì)羥基苯甲酸乙酯（純度99.0%）、對(duì)羥基苯甲酸丙酯（純度＞95%）、對(duì)羥基苯甲酸異丁酯（純度＞95%）、對(duì)羥基苯甲酸丁酯（純度99.9%）、對(duì)羥基苯甲酸庚酯（純度99.9%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH；對(duì)羥基苯甲酸異丙酯（純度100%）、對(duì)羥基苯甲酸異辛酯（純度≥98%），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；對(duì)羥基苯甲酸苯酯（純度98%）、對(duì)羥基苯甲酸正戊酯（純度97%），加拿大Toronto Research Chemicals 公司；對(duì)羥基苯甲酸芐酯（純度100%，美國(guó)AccuStandard 公司）；對(duì)羥基苯甲酸異戊酯（純度99.6%，廣州佳途科技股份有限公司）；對(duì)羥基苯甲酸己酯（純度≥98%）、對(duì)羥基苯甲酸壬酯（純度≥98%），東京化成工業(yè)株式會(huì)社；對(duì)羥基苯甲酸正辛酯（純度98%，阿法埃莎（中國(guó)）化學(xué)有限公司）；甲醇（HPLC 級(jí)，德國(guó)Merck 公司）；甲酸銨（色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理取適量水果，按照GB 2763-2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》附錄A［27］測(cè)定部位要求制備試樣，混合均勻，稱取1.0 g（精確至0.001 g）樣品于15 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL甲醇，渦旋振蕩1 min，超聲20 min。4 000 r/min離心2 min，上清液過0.22 μm尼龍膜，備用，待測(cè)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取適量17 種對(duì)羥基苯甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解后定容，折算濃度后，得到1 000 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存。標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL于同一10 mL容量瓶中，甲醇定容，得到10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。工作曲線：分別使用甲醇和空白基質(zhì)液（選取陰性樣品按“1.2.1”處理后得到），將標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級(jí)稀釋至2、3、4、5、10、50、100、200 μg/L。

1.2.3 液相色譜條件色譜柱：Agilent EclipsePlus C18RRHD（3.0 mm × 150 mm，1.8 μm，美國(guó)Agilent 公司）；流動(dòng)相：A 為5 mmol/L 甲酸銨水；B 為5 mmol/L 甲酸銨甲醇。梯度洗脫：-3 ～0 min，5%B；0 ～0.5 min，5%B；0.5 ～30 min，5%～80%B；30 ～32 min，80%～95%B；32 ～41 min，95%B。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件電噴霧離子源（ESI）；離子源電壓：4.5 kV；透鏡電壓50 V；鞘氣流速（Sheath gas）（氮?dú)猓?5 unit；輔助氣（Auxiliary gas）（氮?dú)猓? unit；吹掃氣（Sweep gas）：1 unit；離子傳輸管溫度（Capillary temperature）：320 ℃；輔助氣加熱溫度（Auxiliary gas heater temperature）：400 ℃；掃描模式：Full MS/dd-MS2Confirmation，采集范圍100 ～600m/z，負(fù)離子掃描模式；一級(jí)質(zhì)譜分辨率（R）：70 000；二級(jí)質(zhì)譜分辨率為17 500；歸一化碰撞能量（NCE）：10、30、50 eV：測(cè)量數(shù)據(jù)采用賽默飛TraceFinder Software 4.1（美國(guó)Thermo Scientific公司）進(jìn)行采集和處理。17種對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)列于表1。

表1 17種對(duì)羥基苯甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其方法參數(shù)Table 1 Method parameters of 17 parabens standards

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜-色譜條件的優(yōu)化

通過對(duì)17種對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)17種化合物均含有羥基和羰基，其在ESI 離子源電離時(shí)既可脫去氫離子顯示電負(fù)性，又可帶氫離子顯示電正性。分別在電噴霧正、負(fù)模式下對(duì)17 種單標(biāo)溶液（1 mg/L）進(jìn)行質(zhì)譜掃描，結(jié)果顯示7 種分析物在負(fù)模式［M-H］-下響應(yīng)較高，宜采用負(fù)模式進(jìn)行測(cè)定。

分別對(duì)比了5 mmol/L 甲酸銨甲醇-5 mmol/L 甲酸銨溶液、5 mmol/L 甲酸銨乙腈-5 mmol/L 甲酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)的色譜分離效果。結(jié)果表明，使用5 mmol/L 甲酸銨甲醇-5 mmol/L 甲酸銨體系作流動(dòng)相時(shí)，色譜峰形較好，17 種化合物均可達(dá)到基線分離；使用5 mmol/L 甲酸銨乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液體系時(shí)，部分色譜峰變形，影響定量分析。因此最終選擇5 mmol/L 甲酸銨甲醇-5 mmol/L 甲酸銨溶液體系作為流動(dòng)相。優(yōu)化色譜條件后17 種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子流圖見圖1。

圖1 17種對(duì)羥基苯甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子流圖（200 μg/L）Fig.1 XIC chromatograms of 17 parabens standard solutions（200 μg/L）the number denoted was the same as that in Table 1

2.2 提取溶劑種類的選擇

分別稱取1 g陰性蘋果樣品作為測(cè)試基質(zhì)，加入500 μg/kg的17種對(duì)羥基苯甲酸酯，同時(shí)配制空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量分析。分別加入4種不同的提取溶劑（30%乙腈、乙腈、丙酮、甲醇）10 mL，超聲20 min，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次（n=6），以平均回收率作為參考指標(biāo)，考察不同溶劑對(duì)回收率的影響，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，甲醇的提取效率總體最好，回收率為88.1%～100%；采用30%乙腈水溶液提取時(shí)，由于對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物的水溶性差，其回收率較低且沉淀效果差；使用乙腈提取時(shí)，對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物的色譜峰形不佳，使用丙酮提取時(shí)，對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物的回收率為62.3% ～88.3%。由于對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物具有羥基，相比于乙腈、丙酮兩種非質(zhì)子溶劑，含有O—H鍵的質(zhì)子性溶劑甲醇具有更強(qiáng)的提取效果，因此對(duì)羥基苯甲酸酯使用甲醇提取更適合。

2.3 提取溶劑用量的優(yōu)化

由于水果的基質(zhì)較復(fù)雜，目標(biāo)物的提取效率易受水果中其他成分的影響，當(dāng)提取溶劑用量低時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)，提取溶劑用量大時(shí)，則方法的靈敏度降低，因此需對(duì)提取溶劑的用量進(jìn)行優(yōu)化。在同樣條件下，考察了不同甲醇溶劑用量（5、10、15、20 mL）對(duì)17種化合物提取率（回收率）的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)提取溶劑用量在10 mL 時(shí)，17 種化合物的整體提取率較高；當(dāng)用量低于10 mL 時(shí)，整體提取率偏低，且以對(duì)羥基苯甲酸甲酯、丙酯、正戊酯、異戊酯、庚酯、正辛酯、異辛酯、癸酯以及3，5-二氯對(duì)羥基苯甲酸甲酯受影響最大，回收率較10 mL 低10%以上，可能由于基質(zhì)在溶劑中的濃度較高，影響了對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物的提??；當(dāng)提取溶劑大于10 mL，對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物的回收率隨著溶劑量的增加呈下降趨勢(shì)（見圖2），且由于溶劑用量增加，稀釋倍數(shù)增加，方法的靈敏度也隨之下降。

圖2 不同溶劑及用量對(duì)目標(biāo)物回收率的影響Fig.2 Influences of different solvents and dosages on recoveries of analytes the number denoted was the same as that in Table 1

2.4 化合物裂解途徑分析

根據(jù)具體測(cè)得的化合物碎片，推斷了17種對(duì)羥基苯甲酸酯的質(zhì)譜裂解途徑及主要碎片的具體結(jié)構(gòu)（見圖3）。17 種對(duì)羥基苯甲酸酯的分子式差異主要為R1、R2和R3基團(tuán)的不同，除了3，5-二氯對(duì)羥基苯甲酸甲酯，其他化合物失去R1基團(tuán)后，一般可產(chǎn)生m/z136 碎片，該碎片經(jīng)過二次或三次碎裂，可得到m/z108 和m/z93，其余的碎片主要來源于［R1-O］-，但響應(yīng)較低，因此在必要時(shí)，可考慮作為化合物自身的特征碎片進(jìn)行匹配定性。另外，部分化合物m/z61的碎片響應(yīng)較高，該碎片可能是通過苯環(huán)碎裂后生成的，同樣，部分質(zhì)荷比大于93 的碎片也可能存在苯環(huán)碎裂形成的情況，但響應(yīng)均較低，因此不作深入探討。

圖3 化合物的質(zhì)譜裂解途徑分析圖Fig.3 MS fragmentation pathways of analytes

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的探究

考察了獼猴桃、葡萄、草莓、藍(lán)莓、梨、蘋果、油桃、棗、橙子、柑橘、柚子、荔枝、龍眼、火龍果、香蕉、芒果、菠蘿、青橄欖、無花果、蓮霧、西瓜、哈密瓜共22種水果基質(zhì)效應(yīng)的影響，覆蓋了GB 2763-2021 對(duì)水果的所有分類，包括較具代表性的仁果類水果、核果類水果、漿果和其他小型類水果、熱帶和亞熱帶類水果、瓜果類水果［27］。采用“1.2.1”前處理方法，得到空白基質(zhì)液，配制上機(jī)濃度為50 μg/L基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積與相應(yīng)濃度甲醇配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液所得峰面積相比，得到比值K。當(dāng)K＜0.8 時(shí)表示存在基質(zhì)抑制現(xiàn)象，當(dāng)K＞1.2 時(shí)表示存在基質(zhì)增強(qiáng)現(xiàn)象。結(jié)果表明，大部分對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物K值在0.8 ～1.2之間，其中部分水果對(duì)應(yīng)相關(guān)化合物呈基質(zhì)抑制現(xiàn)象，如柚子中3，5-二氯對(duì)羥基苯甲酸甲酯的基質(zhì)效應(yīng)為0.758；無花果中對(duì)羥基苯甲酸甲酯的基質(zhì)效應(yīng)為0.660；菠蘿、青橄欖、柚子中對(duì)羥基苯甲酸異丁酯的基質(zhì)效應(yīng)分別為0.742、0.717、0.751；青橄欖中對(duì)羥基苯甲酸正丁酯的基質(zhì)效應(yīng)為0.739。部分呈現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)作用，如油桃、橙子中對(duì)羥基苯甲酸異辛酯的基質(zhì)效應(yīng)分別為1.286、1.291；對(duì)羥基苯甲酸正辛酯、對(duì)羥基苯甲酸正壬酯、對(duì)羥基苯甲酸癸酯在大部分水果中存在基質(zhì)增強(qiáng)現(xiàn)象，基質(zhì)效應(yīng)在0.871 ～3.150之間。結(jié)果顯示，隨著對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物碳鏈增長(zhǎng)或給電子能力變強(qiáng)，其基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)整體呈上升趨勢(shì)，可能原因?yàn)樗衅毡榇嬖诘某煞謪f(xié)同使得給電子能力更強(qiáng)的化合物去質(zhì)子效果更好，引起基質(zhì)增強(qiáng)作用。因此當(dāng)檢出基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)物質(zhì)時(shí)，應(yīng)使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

2.6 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

選取22 種不同水果經(jīng)過本方法前處理后，配制混合標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)曲線，以分析物的質(zhì)量濃度為X，以其相應(yīng)峰面積為Y，擬合線性方程，獲得17種對(duì)羥基苯甲酸酯的線性范圍（見表2）。取基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以本方法的儀器條件進(jìn)行測(cè)定，由于部分對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物在高分辨質(zhì)譜無基線噪音，因此無法采用S/N計(jì)算方法檢出限和定量下限。本方法采用陰性獼猴桃、葡萄、草莓、藍(lán)莓、梨、蘋果、油桃、棗、橙子、柑橘、柚子、荔枝、龍眼、火龍果、香蕉、芒果、菠蘿、青橄欖、無花果、蓮霧、西瓜、哈密瓜共22種水果基質(zhì)，通過添加不同水平的17種對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物，測(cè)得可獲得碎片離子的最低質(zhì)量濃度作為定量下限，并以定量下限最高的水果基質(zhì)表示方法定量下限。確定定量下限后，以約1/3質(zhì)量濃度對(duì)相對(duì)應(yīng)的基質(zhì)進(jìn)樣，當(dāng)出現(xiàn)1個(gè)以上碎片，定義為檢出限。測(cè)定結(jié)果見表2，17種對(duì)羥基苯甲酸酯的方法檢出限為5 ～30 μg/kg，方法定量下限為20 ～100 μg/kg。

表2 17種對(duì)羥基苯甲酸酯的線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r2）、檢出限（LOD）及定量下限（LOQ）Table 2 Linear ranges，correlation coefficients（r2），LODs and LOQs of 17 parabens

2.7 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

為驗(yàn)證方法的回收率和穩(wěn)定性，選擇17種目標(biāo)物均呈陰性的22種水果為樣品，添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，最終樣品中的加標(biāo)濃度為1倍、2倍和5倍定量下限。按本方法對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行處理，并于同一日內(nèi)進(jìn)行6個(gè)平行樣品測(cè)定（n=6），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。在22種水果中，17種對(duì)羥基苯甲酸酯的回收率為70.7%～117%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.5%～4.8%。除了個(gè)別基質(zhì)或某一加標(biāo)水平的結(jié)果存在偏差，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，方法的回收率和RSD基本能滿足方法學(xué)的驗(yàn)證要求，可用于日常實(shí)驗(yàn)室的批量測(cè)定。

表3 17種對(duì)羥基苯甲酸酯的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of 17 parabens（n=6）

(續(xù)表3)

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

為進(jìn)一步驗(yàn)證方法可行性，隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)室的上述22 種水果樣品進(jìn)行測(cè)定，每種水果10 個(gè)，共220 個(gè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，包括1 個(gè)荔枝、1 個(gè)龍眼、1 個(gè)奇異果、1 個(gè)獼猴桃和2 個(gè)芒果在內(nèi)的6 個(gè)樣品中檢出對(duì)羥基苯甲酸甲酯，含量分別為105、242、169、108、234、845 μg/kg。另外還有1個(gè)芒果樣品，對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸乙酯均有檢出，含量分別為233、220 μg/kg（如圖4）。其余樣品均未檢出。

圖4 陽(yáng)性芒果樣品中對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸乙酯的提取離子流圖Fig.4 Selected ion chromatograms of methylparaben and ethylparaben in a mango positive sample

3 結(jié) 論

本文基于直接溶劑超聲提取的方式，對(duì)不同水果中的17種對(duì)羥基苯甲酸酯進(jìn)行快速測(cè)定；采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線校正結(jié)果，回收率滿足分析測(cè)定要求；使用UPLC-Q-Orbitrap HRMS 進(jìn)行分析測(cè)定，精確測(cè)得目標(biāo)物母離子及子離子的分子量，大大降低了假陽(yáng)性的可能，并通過碎片分子量推斷出目標(biāo)物的質(zhì)譜裂解途徑；該方法建立了17種對(duì)羥基苯甲酸酯的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，可有效實(shí)現(xiàn)不同水果中對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物的快速檢測(cè)。方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，回收率和精密度良好，可為水果中防腐劑的快速檢測(cè)提供參考。