吳肖肖，蔣迪堯，梅秀明，康學(xué)軍，李雨楓，張 馳*

（1.南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院 國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（生物毒素分析與評(píng)價(jià)），江蘇 南京 210019；2.東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210096）

糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoids，GCs）為類固醇激素，是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類甾體激素，具有抗炎、抗過敏、抗毒、抗休克等藥理作用，同時(shí)能提高飼料的轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)畜禽生長，因而在畜牧業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用［1-3］。然而，過量的不合理使用會(huì)導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素類藥物在動(dòng)物體內(nèi)殘留，進(jìn)而危害人體健康，引起肥胖、高血壓等疾?。?-5］。因此，各國對(duì)動(dòng)物源性食品中糖皮質(zhì)激素的最大殘留量進(jìn)行了規(guī)定。如GB 31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》［6］和歐盟法規(guī)（EU）No.37/2010［7］均規(guī)定牛奶中倍他米松和地塞米松的最大殘留量為0.3 μg/kg，氫化可的松僅作外用，未指定殘留限量。

目前，同時(shí)測(cè)定多種糖皮質(zhì)激素的方法主要有液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法以及毛細(xì)管電泳法等［8-17］。高效液相色譜-質(zhì)譜法因具有高靈敏度和高選擇性，是痕量分析的常用方法，但其樣品需凈化以減少基質(zhì)干擾，而傳統(tǒng)的固相萃取前處理方法比較耗時(shí)費(fèi)力［18］。

靜電紡絲是一種在強(qiáng)電場作用下將聚合物溶液噴射拉伸得到直徑為納米級(jí)纖維的紡絲技術(shù)。靜電紡絲納米纖維具有直徑小、比表面積大、孔隙率高、易于修飾等特點(diǎn)，基于納米纖維的固相萃取技術(shù)具有操作簡單、快速、有機(jī)溶劑用量少的優(yōu)點(diǎn)［19-21］。本研究制備了聚苯乙烯（PS）納米纖維，并對(duì)其形貌、特征基團(tuán)、接觸角、比表面積等參數(shù)進(jìn)行表征，利用強(qiáng)疏水性PS納米纖維對(duì)有環(huán)戊烷駢多氫菲結(jié)構(gòu)的糖皮質(zhì)激素的良好吸附性，通過納米纖維固相萃取技術(shù)對(duì)樣品提取液中的糖皮質(zhì)激素進(jìn)行富集與凈化，基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS），建立了牛奶中潑尼松龍等25 種糖皮質(zhì)激素的檢測(cè)方法，并將該方法應(yīng)用于市售牛奶樣品檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1290-6470 超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源（美國安捷倫科技有限公司）；ML304T 分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；Centrifuge 5430R 低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；N-EVAP 112 氮吹儀（美國Organomation 公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；Vortex-Genie 2 渦旋振蕩器（美國Scientific Industries 公司）；DWP403-1AC 高壓電源（天津東文高壓電源廠）；SU8010場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本株式會(huì)社日立制作所）；JEOL JEM-00F高分辨透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；Alpha 傅里葉紅外光譜儀（德國布魯克光譜儀器公司）；CHD-JCJ180A-1接觸角測(cè)量儀（東莞誠鼎儀器科技有限公司）；ASAP 2460 全自動(dòng)比表面與孔隙度分析儀（美國麥克默瑞提克儀器公司）。

1.2 試劑與材料

標(biāo)準(zhǔn)品：潑尼松龍、潑尼松、氫化可的松、甲基潑尼松龍、倍他米松、地塞米松、倍氯米松、曲安奈德、氟氫縮松、地塞米松醋酸酯和氫化可的松丁酸酯（100 mg/L，溶于甲醇）；可的松（1 000 mg/L，溶于甲醇），氟米松（純度≥99.8%），氟氫可的松醋酸酯、可的松醋酸酯、甲基潑尼松龍醋酸酯、倍他米松醋酸酯（純度≥99.5%），購自上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；潑尼松龍醋酸酯（100 mg/L，溶于甲醇）、曲安西龍雙醋酸酯（1 000 mg/L，溶于甲醇）、氫化可的松醋酸酯（純度＞99%），氟米龍醋酸酯（100 mg/L，溶于乙腈），購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；地夫可特（純度≥99%）、布地奈德（純度≥98%），購自多倫多化學(xué)研究所；潑尼松醋酸酯（純度≥98%，中國食品藥品檢定研究院）；氟米龍（純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

乙腈、甲醇（LC-MS 級(jí)，純度≥99.9%），購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲酸、乙酸（HPLC級(jí)，純度≥99.9%），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚苯乙烯（18 500 Da），購自上?；瘜W(xué)試劑研究院；四氫呋喃（THF）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）（分析純，純度≥99.59%），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

不同品牌的牛奶實(shí)際樣品隨機(jī)購自南京市中、大型超市。

1.3 納米纖維制備、表征及固相萃取柱的制備

1.3.1 納米纖維制備將1 g PS溶于10 mL THF和DMF的混合溶劑（6∶4，體積比）中，在室溫下攪拌16 h。將混合紡絲溶液裝入玻璃注射器中（配不銹鋼針頭），用導(dǎo)線連接不銹鋼針與高壓電源正極，收集屏連接電源負(fù)極，距離不銹鋼針20 cm處放置。在24 kV電壓下，以2.0 mL/h速度推進(jìn)溶液，噴出的纖維落于鋁箔收集屏上，得到PS納米纖維。

1.3.2 納米纖維表征分別用場發(fā)射掃描電子顯微鏡、高分辨透射電子顯微鏡、傅里葉紅外光譜儀、接觸角測(cè)量儀和全自動(dòng)比表面與孔隙度分析儀對(duì)PS 納米纖維的形貌、特征峰、吸附性能等指標(biāo)進(jìn)行表征。

1.3.3 凈化柱的制備與活化稱取8 mg 納米纖維，用實(shí)心金屬圓柱體送至固相萃取柱下端，壓緊制成固相萃取小柱。依次取200 μL甲醇和400 μL水流過柱內(nèi)纖維，完成固相萃取柱的活化。

1.4 溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶解或稀釋配制成質(zhì)量濃度為1 000 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，置于4 ℃冰箱中備用。

乙酸水-甲醇溶液：50%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸水溶液和甲醇以體積比2∶98混合而成。

1.5 樣品處理

精確稱取0.5 g 牛奶于10 mL 離心管中，加入5 mL 乙腈，渦旋5 min，以7 500 r/min 離心15 min，取上清液，氮?dú)獯蹈?。? mL 5%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈水溶液溶解，過0.22 μm 有機(jī)濾膜，過活化后的PS納米纖維固相萃取柱，用100 μL 甲醇洗脫固相萃取柱，收集洗脫液，待質(zhì)譜檢測(cè)。樣品處理流程見圖1。

圖1 樣品處理流程圖Fig.1 Flow chart of sample processing

1.6 色譜-質(zhì)譜條件

1.6.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C1（82.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0 ～4.5 min，20%B；4.5 ～7 min，20%～45%B；7 ～9 min，45% ～52% B；9 ～10 min，52% ～55% B；10 ～12 min，55% ～65% B；12 ～14 min，65% ～90%B；14 ～15 min，90%B；后運(yùn)行：2 min；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃。

1.6.2 質(zhì)譜條件離子源：雙噴射流電噴霧離子源（Dual AJF ESI），掃描模式：正離子模式，檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；霧化器壓力：310 kPa；氣體溫度：350 ℃，氣體流速：12 L/min；鞘氣（N2）溫度：250 ℃，鞘氣（N2）流速：11 L/min；毛細(xì)管電壓：3 500 V。25 種糖皮質(zhì)激素的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 25種糖皮質(zhì)激素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectral parameters of 25 glucocorticoids

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維表征

2.1.1 纖維形貌與紅外表征在掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）下，PS 納米纖維的SEM 圖、TEM 圖以及直徑分布圖見圖2A-C。由圖可知，PS納米纖維表面光滑，無明顯串珠，纖維的平均直徑為（818.3±297.5）nm。

PS 納米纖維的紅外光譜圖見圖2D。根據(jù)特征峰［22］判斷，纖維的主成分是PS，其中特征峰696、756 cm-1來自單取代苯環(huán)===== CH 面外變形，1 028 cm-1來自單取代苯環(huán)===== CH 面內(nèi)變形，1 452、1 493、1 601 cm-1來自苯環(huán)—C===== C—彎曲振動(dòng)，2 849 cm-1來自—CH2—對(duì)稱伸縮振動(dòng)，2 922 cm-1來自—CH2—不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，3 001、3 025、3 064、3 084 cm-1來自===== CH—伸縮振動(dòng)。

圖2 PS納米纖維的SEM圖（A）、TEM圖（B）、直徑分布圖（C）和紅外光譜圖（D）Fig.2 SEM（A），TEM（B），diameter distribution images（C）and infrared spectrum（D）of PS nanofibers

2.1.2 纖維接觸角與比表面積采用接觸角測(cè)量儀測(cè)得PS 納米纖維的接觸角為136.12°，表明PS 納米纖維具有良好的疏水性，對(duì)具有環(huán)戊烷駢多氫菲結(jié)構(gòu)的疏水性糖皮質(zhì)激素有較好的吸附性。經(jīng)測(cè)試，PS納米纖維的比表面積為57.41 m2/g，孔體積為0.33 cm3/g，平均孔徑為24.33 nm。根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）規(guī)定的孔尺寸定義，PS納米纖維表面的孔為介孔（2 ～50 nm）。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

為提高分析效率，在盡可能縮短保留時(shí)間的同時(shí)，需將25種糖皮質(zhì)激素最大程度地分離，尤其是具有相同定性和定量離子對(duì)的倍他米松與地塞米松，以及倍他米松醋酸酯與地塞米松醋酸酯2 對(duì)同分異構(gòu)體，必須以保留時(shí)間的差別加以區(qū)分。經(jīng)過優(yōu)化梯度洗脫程序、碰撞能等色譜-質(zhì)譜條件，25種糖皮質(zhì)激素以及2 對(duì)同分異構(gòu)糖皮質(zhì)激素均能通過色譜峰的保留時(shí)間或離子對(duì)質(zhì)荷比的差異實(shí)現(xiàn)定性和定量，提取離子流色譜圖見圖3。

圖3 25種糖皮質(zhì)激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）與2組同分異構(gòu)糖皮質(zhì)激素（B）的提取離子流色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms（EIC）of 25 glucocorticoids mixed standard solution（A）and two pairs of isomeric glucocorticoids（B）the numbers marked in the EIC represent the same analytes as those in Table 1

2.3 萃取條件優(yōu)化

納米纖維固相萃取技術(shù)的原理是通過纖維和目標(biāo)物之間的相互作用力實(shí)現(xiàn)吸附，再將吸附在纖維上的目標(biāo)物解離。因此，纖維對(duì)目標(biāo)物的作用力既要能實(shí)現(xiàn)吸附，又不能有太強(qiáng)的吸附，否則難以洗脫。由纖維表征結(jié)果可知，PS納米纖維的疏水性強(qiáng)，通過π-π鍵共軛作用可實(shí)現(xiàn)對(duì)有環(huán)戊烷駢多氫菲結(jié)構(gòu)的糖皮質(zhì)激素的吸附。將5%乙腈水溶液稀釋配制的25種糖皮質(zhì)激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（20 μg/L）過活化后的PS納米纖維柱，按照公式（1-殘留在柱后溶液中目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)/標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜響應(yīng)）×100%計(jì)算吸附效率，結(jié)果顯示25種糖皮質(zhì)激素的吸附效率均大于95%。分別采用甲醇、乙酸水-甲醇溶液對(duì)吸附在纖維上的目標(biāo)物進(jìn)行洗脫，通過洗脫液與相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜響應(yīng)比值計(jì)算得到目標(biāo)物的提取效率，結(jié)果見圖4。由圖可知，雖然潑尼松、潑尼松龍等6個(gè)糖皮質(zhì)激素的提取效率在酸性條件下略高于甲醇，但可的松醋酸酯、氟氫可的松醋酸酯等目標(biāo)物在酸性條件下的提取效率極低，無法滿足檢測(cè)要求。而甲醇洗脫時(shí)，25種目標(biāo)物的提取效率為83.6%～109%，可滿足檢測(cè)要求。因此，選擇甲醇作為洗脫溶劑。

圖4 不同洗脫溶劑對(duì)25種糖皮質(zhì)激素提取效率的影響（n=3）Fig.4 Effect of different elution solvents on extraction efficiency of 25 glucocorticoids（n=3）

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察

為考察牛奶樣品中25 種糖皮質(zhì)激素的基質(zhì)效應(yīng)（ME），將空白牛奶樣品按照“1.5”方法進(jìn)行處理，得到空白樣品基質(zhì)。采用空白樣品基質(zhì)和甲醇分別配制1 ～100 μg/L 系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.6”條件進(jìn)行檢測(cè)，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率百分比（SR）評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。SR越接近100%，表明基質(zhì)效應(yīng)越??；SR ＜100%，表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；SR ＞100%，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。結(jié)果顯示，25 種糖皮質(zhì)激素的SR 在94.4%～104%范圍內(nèi)，表明采用聚苯乙烯納米纖維固相萃取柱對(duì)牛奶樣品提取液進(jìn)行萃取處理，達(dá)到了較好的基質(zhì)凈化作用。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限準(zhǔn)確移取適量的25種糖皮質(zhì)激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用5%乙腈水溶液配成質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用本方法處理后進(jìn)行檢測(cè)。采用外標(biāo)法定量，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/L），相應(yīng)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，25 種糖皮質(zhì)激素在1 ～100 μg/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.995。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白牛奶樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)濃度逐級(jí)遞減，按本方法處理后進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算檢出限（LOD，S/N≥3）和定量下限（LOQ，S/N≥10）。結(jié)果顯示，25 種糖皮質(zhì)激素的LOD為0.04 ～0.10 μg/kg，LOQ為0.13 ～0.33 μg/kg（見表2）。

表2 25種糖皮質(zhì)激素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients，LODs and LOQs of 25 glucocorticoids

（續(xù)表2）

2.5.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，在空白牛奶樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液使待測(cè)物含量分別為0.5、5.0、20.0 μg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平平行制備6份樣品，采用本方法處理后上機(jī)測(cè)定。根據(jù)溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果表明，25 種糖皮質(zhì)激素的回收率為71.5%～105%，RSD為1.8%～10%（見表3）。

表3 25 種糖皮質(zhì)激素的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of 25 glucocorticoids（n=6）

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用本方法檢測(cè)市售10 批次牛奶樣品中25 種糖皮質(zhì)激素的含量，僅在1 批次樣品中發(fā)現(xiàn)微量的氫化可的松（圖5），含量為0.35 μg/kg，國標(biāo)中未指定其殘留限量。其余樣品均未檢出25 種糖皮質(zhì)激素殘留。

圖5 陽性樣品的提取離子色譜圖Fig.5 EIC of the positive milk sample

3 結(jié) 論

本研究采用納米纖維固相萃取法進(jìn)行前處理，以聚苯乙烯納米纖維固相萃取柱進(jìn)行富集、凈化，基于UPLC-MS/MS 技術(shù)建立了牛奶中25 種糖皮質(zhì)激素的檢測(cè)方法。該方法具有前處理操作簡單，有機(jī)溶劑用量少，基質(zhì)效應(yīng)不顯著，準(zhǔn)確性好，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于牛奶中糖皮質(zhì)激素殘留的檢測(cè)。