吳惠娟 唐恒坤 楊敏儀 陳 睿 高燁宏 王榮智 汪世華

(1.生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002)

1 概述

由于生態(tài)環(huán)境的變化和人類經(jīng)濟活動的發(fā)展，全球范圍內(nèi)已記錄到的有害藻華(HABs)不斷增加。海洋中引起赤潮的藻類多達(dá)3000多種，赤潮的發(fā)生危害生態(tài)系統(tǒng)和漁業(yè)經(jīng)濟，其特點是浮游植物快速增殖并產(chǎn)生大量代謝物質(zhì)，引起海水顏色的改變。目前，其形成機制尚不清楚，已有多項研究表明，水溫上升和過量養(yǎng)分是導(dǎo)致藻類大量生長的主要觸發(fā)因素[1]。

Brevetoxins (BTxs) 是一類親脂性環(huán)狀聚醚神經(jīng)毒素，屬于一類神經(jīng)性貝毒 (NSP)，目前發(fā)現(xiàn)了約70種衍生物。這類毒素在貝類中積累，主要以BTx-1 (A型) 和BTx-2 (B型)兩種形式存在[2]，過量攝入、皮膚接觸或氣溶膠吸入是最常見的中毒途徑[3-4]。接觸這類毒素產(chǎn)生的癥狀通常在攝入后1～24h出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉、呼吸道刺激、流鼻涕、鼻子和喉嚨的燒灼感、支氣管收縮、感覺異常、頭暈、失去協(xié)調(diào)、抽筋、癱瘓等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致昏迷，但是目前還沒有可用的解毒劑[5]。已有研究表明，高濃度的毒素可能會在以浮游植物為食的其他海洋生物中積聚，并逐級傳遞到人類身上；也有研究檢測了海水[2-3]、空氣[6-7]及其他生物體中毒素含量，揭示了其對呼吸道的刺激作用。BTxs的作用機制是通過特異性結(jié)合電壓門控Na+通道的第5位點，導(dǎo)致通道被持續(xù)激活，大量Na+流入使神經(jīng)元和肌肉膜去極化[8]。吸入BTxs后的癥狀會在接觸后幾分鐘到幾小時 (<24h) 開始出現(xiàn)，持續(xù)2～3天[9]。另外，還有研究指出這類毒素可能會誘導(dǎo)DNA損傷和造成染色體畸變[10]。

產(chǎn)生此類毒素的藻類所引起的赤潮常在美國弗羅里達(dá)洲和墨西哥灣爆發(fā)，且近幾年報道了許多生物因BTxs中毒的事件，例如海龜[11]、綠樹蛙[12]、石蟹[13]、海豚[14]和燕鷗[15]，在歐洲其他國家和中國海岸也有檢測到此類毒素。本文主要關(guān)注BTxs的研究現(xiàn)狀、BTxs檢測標(biāo)準(zhǔn)和BTxs檢測方法的研究進展。

2 BTxs研究現(xiàn)狀及熱點

近幾年報道了多種生物死亡、擱淺的現(xiàn)象，如海龜、綠樹蛙、石蟹、海豚和燕鷗等均檢測出BTxs。還有報道提出在赤潮泛濫的沿海地區(qū)，BTxs可能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病[16]和急性發(fā)作性血管性水腫[17]有關(guān)。在澳大利亞、新西蘭和日本也有相似報道[18]。近幾年研究主要關(guān)注各種生物體BTxs的檢測和方法創(chuàng)新，以及在自然條件和實驗室條件下成年蛤蜊在繁殖期間受BTxs的影響[19]，以及對其后代產(chǎn)生的影響。此外，還有少部分研究者關(guān)注BTxs分子對離子通道的相互作用研究[20-21]、毒素分子的代謝組學(xué)和其他組學(xué)的應(yīng)用[22-23]。有趣的是，基于BTxs暴露于神經(jīng)元的神經(jīng)再生特性，相關(guān)研究對于中風(fēng)的治療具有重要意義。雖然暴露于環(huán)境中天然存在的BTxs對動物和人類具有強效炎癥效應(yīng)[24]，但是其為模擬中風(fēng)的活動依賴性恢復(fù)[25]研究提供了理論依據(jù)。

3 BTxs檢測標(biāo)準(zhǔn)

美國(東海岸、墨西哥灣)和新西蘭已經(jīng)制定了監(jiān)管限制，可接受的BTxs水平在活的和生的雙殼貝類的食品法典標(biāo)準(zhǔn)為200個小鼠單位(MU)/kg[26]，或0.8 mg BTx-2當(dāng)量/kg總貝類肉[27-28]。在歐洲，目前管制四組親脂性毒素：岡田軟海綿酸、果膠毒素、yessotoxins和氮雜螺環(huán)酸[28]。2018年，在科西嘉島(地中海)的法國貝類中首次檢測到BTxs，同年，為監(jiān)測新出現(xiàn)的毒素，如環(huán)狀亞胺、卵毒素和BTxs等，法國海岸建立了一個名為EMERGTOX的監(jiān)測計劃。為了保護消費者的健康，我國針對發(fā)現(xiàn)的主要海洋毒素建立了一套海產(chǎn)品安全標(biāo)準(zhǔn)。目前，我國已經(jīng)建立了多溴二苯甲醚的分析方法，并將其應(yīng)用于雙殼類、海水、浮游植物和沉積物樣品中的毒素檢測。

4 BTxs檢測方法研究進展

到目前為止，BTxs檢測的方法有小鼠生物測定(MBA)、受體結(jié)合測定、ELISA法、電化學(xué)測定和LC-MS[33-34]等。

4.1 MBA法

自2013年以來，歐盟國家對于親脂性毒素的檢測均采用MBA衡量某類物質(zhì)對于生物體的毒性[9]，通過乙醚從貝類研磨物中提取毒素，并給小鼠注射，觀察小鼠反應(yīng)。這種測定方法在貝類養(yǎng)殖場和市場監(jiān)測項目中應(yīng)用廣泛，對于進一步確認(rèn)其他化學(xué)結(jié)構(gòu)及功能和確定監(jiān)管毒性水平是十分必要的。

4.2 受體結(jié)合測定

受體結(jié)合法基于毒素分子與離子通道的相互作用，BTxs與Na+特異結(jié)合。Mccall等[31]開發(fā)了一種基于大鼠腦突觸體作為受體和BTx-2作為BTx類似物的熒光探針的競爭性結(jié)合試驗。此外，Murata等[32]開發(fā)了基于大鼠腦突觸體和吖啶-BTx-2的化學(xué)發(fā)光受體結(jié)合試驗，檢測限為1.4 amol。然而，突觸體不穩(wěn)定，需要在-80°C下儲存，并且該測定是一個耗時的過程。小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞毒性試驗 (N2a-assay) 是一種靈敏、高通量的體外檢測方法，可有效檢測Na+通道特異性海洋生物毒素。Loeffler等[33]通過添加藥物哇巴因和藜蘆定來實現(xiàn)對激活Na+通道的化合物的測定。然而，添加的藥物可能對N2a細(xì)胞有毒，并且它們在濃度不足或過高的情況下應(yīng)用會降低該測定法對海洋毒素檢測的有效性。Viallon等[34]評估了N2a-assay的6個關(guān)鍵參數(shù)：細(xì)胞接種密度、生長26小時后的細(xì)胞層活力、噻唑藍(lán)孵育時間、哇巴因和藜蘆苷處理以及溶劑和基質(zhì)效應(yīng)，確定了用于驗證N2a-assay的五個可行性控制，實現(xiàn)了對BTx-3的特異性檢測。該方法雖然靈敏度很高，但產(chǎn)生的結(jié)果波動相對較大且需要18～24h才能完成。Caglayan等[35]基于適配體的檢測方法用于BTxs檢測，該法在水溶液中的檢測限分別為1.48 nM和0.80 nM。

4.3 ELISA法

ELISA法具備高特異性，能夠?qū)崿F(xiàn)快速的現(xiàn)場檢測，在海產(chǎn)品進出口檢測中發(fā)揮了重要作用。Ling等[36]以BTx-1為靶標(biāo)，開發(fā)了具備高特異性、檢測限為200 ng/mL的膠體金試紙條。近幾年，研究者主要采用ELISA和LC-MS檢測方法，更側(cè)重于試劑盒的適用性評估、LC-MS的檢測優(yōu)化以及其他方法的優(yōu)化改良。比如Cunningham等[37]通過采集血液樣本評估市售最初用于定量海水和貝類組織提取物中的BTx-3的ELISA(多克隆抗體)試劑盒，表明該試劑盒可準(zhǔn)確定量人血漿中0.0400～2.00 ng/mL的BTx-3，但對其他常見BTx類似物具有不同的交叉反應(yīng)性，因此仍需要通過更有針對性的方法進行鑒定(如LC-MS)。

4.4 電化學(xué)檢測

傳統(tǒng)的ELISA法具有局限性，而電化學(xué)方法具有高靈敏度、低成本、低功耗和高度兼容的特點，適用于小型傳感器和自動檢測。研究者多采用在免疫檢測的基礎(chǔ)上開發(fā)，結(jié)合電化學(xué)方法放大信號的策略。Zhang等[38]在競爭性免疫測定的基礎(chǔ)上，使用可區(qū)分的金屬納米簇標(biāo)記分子，設(shè)計了一種新的超靈敏多重免疫測定方案，檢測限為1.8pg/mL。這種方法與傳統(tǒng)電化學(xué)標(biāo)記相比，可以產(chǎn)生非常靈敏特定的信號；相對于傳統(tǒng)的酶標(biāo)方法，金屬納米團簇顯得簡單且通用，不僅不需要酶底物，而且減少了對分析物的污染。Zhang等[39]利用聚苯乙烯微球與二氧化硅納米容器中的特定抗體結(jié)合，通過伏安法檢測納米容器內(nèi)的亞甲藍(lán)釋放量進行快速檢測，其檢測限為6 pg/mL。Zhang等[40]建立了較常規(guī)方法更靈敏、抗體用量更少、更快速的基于毛細(xì)管電泳的免疫檢測方法(CE-IA)，檢測限為100pg/mL，是分析貝類樣品中BTxs的有力工具。Tang等[41]基于競爭結(jié)合的原理，建立了一種檢測限為0.6pg/mL，基于新型石英晶體微天平(QCM)的免疫傳感策略。通過苯氧基官能化葡聚糖(DexP)組裝到石墨烯包被的QCM探針的表面上，然后通過葡聚糖結(jié)合刀豆蛋白A(ConA)標(biāo)記的小鼠單克隆抗BTx-2抗體并固定在DexP修飾的探針上，以葡萄糖淀粉酶和牛血清白蛋白-BTx-2(BTx-2-BSA)偶聯(lián)物高度官能化的金納米顆粒作為標(biāo)簽進行檢測。Eissa等[42]通過體外選擇高親和力DNA適配體并使用熒光和電化學(xué)阻抗譜(EIS)監(jiān)測BTx-2與適配體的結(jié)合，開發(fā)了一種基于心肌細(xì)胞的便攜式生物傳感器，可以提供一種無標(biāo)記且方便的方式來實時監(jiān)測心肌細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的自發(fā)電活動，大大縮短了海洋毒素的檢測時間。這種適配體BT10用于構(gòu)建BTx-2的無標(biāo)記競爭性阻抗生物傳感器，檢測限為106pg/mL。

4.5 質(zhì)譜檢測

液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)結(jié)合了液相色譜的分離能力、三重四極桿質(zhì)譜的高靈敏度和選擇性質(zhì)量分析能力，具備高度的靈敏性和特異性，成為測定和定量BTxs的寶貴工具。Shin等[43]為BTx-1、BTx-2和BTx-3毒素開發(fā)了LC-MS/MS，定量限為25μg/kg。同樣，Wunschel等[44]針對包含BTx的多種毒素開發(fā)了一種電噴霧LC-MS/MS系統(tǒng)，每種毒素的檢測限為2.5 μg/kg。Dom等[45]建立了一個高分辨率LC-MS系統(tǒng)來檢測貽貝和牡蠣中的14種毒素。然而，ELISA法或LC-MS/MS方法受到多個因素的影響，需要聯(lián)合其他現(xiàn)代技術(shù)。液相色譜—高分辨率質(zhì)譜具有高精度和高分辨率，該技術(shù)在未知化合物的發(fā)現(xiàn)和鑒定中發(fā)揮著重要作用。已有研究報道了一種快速、靈敏、可用于定量兩種雙殼貝類基質(zhì)中的八種環(huán)亞胺和兩種BTxs類似物的超高液相色譜—MS/MS(UHPLC-MS/MS)方法[46]。為分析環(huán)境樣品、海洋生物和水中的毒素，Onofrio等[47]開發(fā)了兩種方法來篩選13種毒素，使用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測到特定的毒素。捕集器和柱內(nèi)稀釋(ACD)技術(shù)的聯(lián)合使用具備提高檢測限、實現(xiàn)多種毒素組的共同檢測、可注入100%有機溶劑樣品、確保分析物穩(wěn)定性并消除繁雜的樣品制備步驟，進樣體積可達(dá)1mL，從而使分析物的檢測限在0.001～0.05μg/L之間的優(yōu)點。液相色譜—飛行時間質(zhì)譜 (LC-ToF-MS) 是一種常見的液相色譜—高分辨率質(zhì)譜類型。液相色譜—串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(LC-QqQ-MS/MS)靈敏度高，有利于準(zhǔn)確檢測海洋環(huán)境中低濃度的目標(biāo)化合物。已有研究通過建立一種基于二者結(jié)合的改進方法[48]，用于分析K.brevis產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外BTxs代謝物。該方法可用于快速鑒定和進一步測定在實驗室培養(yǎng)的不同生長階段K.brevis的BTxs代謝物的產(chǎn)生。LC-ToF-MS和LC-QqQ-MS/MS技術(shù)相輔相成，可以對不同環(huán)境條件樣品中BTxs代謝物譜進行全面篩選和準(zhǔn)確鑒定。

5 研究展望

如前所述，研究人員均采取ELISA法初步檢測和LC-MS/MS鑒定化合物的方法評估毒素含量。MBA法能真實反映毒素分子毒性，目前仍是許多國家進行貝類產(chǎn)品檢測的選擇；N2a-assay檢測基于受體特異而非毒素分子特異，因而應(yīng)用受到了限制；質(zhì)譜串聯(lián)檢測能精確鑒定毒素分子但僅限于實驗室內(nèi)應(yīng)用；電化學(xué)傳感器和ELISA方法的結(jié)合應(yīng)用正在進行大量的研究。在實際應(yīng)用過程中，采取先使用免疫測定法檢測廣泛的BTxs，然后進行色譜確認(rèn)的檢測策略可以加快鑒定流程，然而采用此種策略對于市場售賣的ELISA試劑盒的精確度和特異性提出了更高要求。雖然研究者提出了許多檢測策略，但是目前還沒有統(tǒng)一、高效的BTxs檢測方法。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和大量新的、對人體有害的毒素的發(fā)現(xiàn)，僅依賴于事先確立的毒素目標(biāo)清單進行檢測的策略已不適用。在我國，檢測也僅限于在名錄內(nèi)的毒素，對于非名錄毒素的檢測缺乏有效的檢測手段。因此，進一步構(gòu)建一個對于BTxs和NSP的動態(tài)預(yù)防監(jiān)測體系將有利于檢測和發(fā)現(xiàn)新的毒素，為后期采取及時而有效的應(yīng)對措施提供技術(shù)支持。