侯聰霞 孫 芳 梁亞林

1 河南省胸科醫(yī)院呼吸與危重癥一病區(qū) (鄭州 450000) 2 鄭州市第七人民醫(yī)院腎移植腎病診療中心(鄭州 450016)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)具有較高的發(fā)病率和病死率，給患者及社會帶來沉重負擔，目前尚沒有阻止或逆轉(zhuǎn)COPD疾病進程的有效治療方法[1]，因此探討其發(fā)病及進展機制對診治有重要的臨床意義。COPD發(fā)病機制復(fù)雜，既往研究證實，免疫失衡是其中重要一環(huán)，而作為機體免疫重要的組成部分，細胞免疫是以T淋巴細胞為主導(dǎo)的[2]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞是一類特殊的T細胞亞群，具有免疫抑制性和免疫無反應(yīng)性，在維持自身耐受、免疫穩(wěn)態(tài)和抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3]。因此，評估COPD患者外周血中的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞及其相關(guān)細胞因子的表達，有助于判斷患者的免疫狀況，為了解免疫系統(tǒng)參與COPD發(fā)生進展機制提供信息?；诖?，本研究納入66例COPD患者作為研究對象，以探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞在COPD患者外周血中的表達，及與合并細菌感染的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2018年1月—2019年12月間收治的66例COPD患者作為研究對象。納入標準：符合COPD診斷標準[4]者；年齡>18歲者；未合并其他嚴重全身性疾病、臟器功能不全者。排除標準：合并其他免疫系統(tǒng)疾病者；合并其他慢性感染性疾病者；合并其他呼吸系統(tǒng)疾病者。本研究對照組納入的均為體檢健康者。66例COPD患者中急性加重期COPD(acute exacerbation COPD,AECOPD)者36例，男26例、女10例，年齡49～74歲，平均年齡(64.83±7.68)歲；穩(wěn)定期COPD者30例，男23例、女7例，年齡51～74歲，平均年齡(65.41±7.54)歲。對照組：男22例、女8例，年齡51～69歲，平均年齡(64.99±7.18)歲。各組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 研究方法

所有研究對象均于入組時采集外周靜脈血標本，使用淋巴分離液常規(guī)分離獲得單個核細胞，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至1×107個/mL，取100 μL懸浮細胞分別加入20 μL CD4-FITC、CD25-APC，混勻后室溫孵育，加入PBS緩沖液混勻、離心后棄去上清液，再次加入0.5 mL PBS緩沖液混勻，采用FACSCalibur型流式細胞儀(美國Bectond-Dickinson公司生產(chǎn))檢測CD4+、CD4+CD25+水平。采用ELISA法測定白介素-4(interleukin-4,IL-4)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)水平，試劑均來自上海晶抗生物工程有限公司。

1.3 觀察指標

對所有納入的研究對象外周血標本中的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞及其相關(guān)細胞因子(IL-4、IL-10、IFN-γ)表達水平進行檢測，分析相關(guān)指標水平與COPD是否合并細菌感染的關(guān)系，及預(yù)測細胞感染的效能。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 外周血T淋巴細胞表達水平

AECOPD和穩(wěn)定期COPD患者CD4+、CD4+CD25+水平均低于對照組(P<0.05)，AECOPD患者CD4+、CD4+CD25+水平低于穩(wěn)定期COPD患者(P<0.05)，見表1。

表1 外周血T淋巴細胞表達水平

續(xù)表

2.2 外周血血清細胞因子表達水平

AECOPD和穩(wěn)定期COPD患者IL-4、IL-10水均高于對照組(P<0.05)，IFN-γ/IL-4水平低于對照組(P<0.05)，AECOPD患者IFN-γ水平高于對照組(P<0.05)；AECOPD患者IL-4、IL-10、IFN-γ均高于穩(wěn)定期COPD患者(P<0.05)，見表2。

表2 外周血血清細胞因子表達水平

2.3 COPD患者外周血T淋巴細胞表達與血清細胞因子的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析法顯示：COPD患者外周血CD4+、CD4+CD25+水平均與IL-4、IFN-γ呈負相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，CD4+水平與IL-10呈負相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，見表3。

表3 COPD患者外周血T淋巴細胞表達與血清細胞因子的相關(guān)性

2.4 COPD合并感染者T淋巴細胞及其相關(guān)細胞因子的水平

36例AECOPD患者中合并細菌感染者27例，其中革蘭氏陰性菌感染者19例、革蘭氏陽性菌感染者8例，無真菌感染病例。COPD合并感染者CD4+水平低于未合并感染者(P<0.05)，IL-4、IFN-γ水平均高于未合并感染者(P<0.05)；COPD合并革蘭氏陰性菌感染者CD4+CD25+水平低于未合并感染者(P<0.05)，IL-10水平均高于未合并感染者(P<0.05)，見表4。

表4 COPD合并感染者T淋巴細胞及其相關(guān)細胞因子的水平

2.5 T淋巴細胞及其相關(guān)細胞因子預(yù)測細菌感染的效能

ROC曲線顯示：CD4+、IL-4、IL-10、IFN-γ均是預(yù)測COPD患者合并細菌感染的有效指標(P<0.05)，其中IL-4和IFN-γ效能較高(P<0.05)，見表5。

表5 T淋巴細胞及其相關(guān)細胞因子預(yù)測細菌感染的效能

圖1 T淋巴細胞及相關(guān)細胞因子的ROC曲線

3 討 論

既往文獻證實，COPD的發(fā)病機制不僅在于肺部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，還在于全身免疫系統(tǒng)的變化，T淋巴細胞除了參與COPD的炎癥過程，還參與調(diào)整COPD的免疫功能[5]。且有研究顯示，T淋巴細胞相關(guān)血清細胞因子在COPD發(fā)病進展中會發(fā)生顯著變化[6]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在COPD并發(fā)肺部感染患者中炎性因子和Th17均呈高表達，Treg呈低表達，Th17/Treg失衡及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可影響患者的肺功能[7]。但在COPD疾病狀態(tài)下，有關(guān)免疫細胞與其血清細胞因子間相互作用機制變化的報道仍少見。這不利于了解細胞免疫在COPD病程中的具體機制，為改善COPD免疫輔助治療及預(yù)測患者細菌感染等病情變化，本研究展開相關(guān)探討。

本研究結(jié)果顯示，不同病情COPD患者CD4+、CD4+CD25+水平均顯著低于健康人群，病情嚴重者調(diào)節(jié)性T細胞表達更低。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞主要通過細胞間接、直接接觸或分泌抑制性細胞因子來抑制自身效應(yīng)性細胞活化，參與免疫負調(diào)節(jié)，維持自身免疫耐受[8]。因此，COPD患者調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量減少，一是表明AECOPD可能由于CD4+CD25+水平減少，而使患者更易發(fā)生病理性免疫應(yīng)答，呼吸系統(tǒng)出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)；二是考慮COPD穩(wěn)定期患者也存在調(diào)節(jié)性T細胞變化，這可能是引起COPD疾病慢性化和反復(fù)發(fā)作的機制之一。不同T細胞具有不同細胞因子產(chǎn)生模式，其中IFN-γ以Th1細胞產(chǎn)生為主，IL-4、IL-10以Th2細胞產(chǎn)生為主[9]，因此觀察IFN-γ、IL-4水平及其比值有助于判斷T細胞因子水平的平衡。在細胞因子層面，本研究數(shù)據(jù)顯示，AECOPD和穩(wěn)定期患者血清細胞因子表達水平均顯著升高，但呈現(xiàn)病情越重、IFN-γ/IL-4比值水平越低的狀況。這說明在COPD患病人群中均出現(xiàn)免疫反應(yīng)，IFN-γ、IL-4水平均升高，但IFN-γ升高幅度不及IL-4，致使患者免疫失衡，與CD4+CD25+Treg細胞降低的趨勢保持一致。IL-4能激活B淋巴細胞合成IgE和IgG1，引起喘息癥狀的發(fā)作和加?。磺夷艽龠M黏液糖蛋白合成，杯狀細胞增生及氣道黏液分泌等，導(dǎo)致了氣道炎癥和重構(gòu)[10]。進一步通過評估Treg細胞與血清細胞因子的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，AECOPD疾病狀態(tài)下，兩者呈現(xiàn)顯著負相關(guān)關(guān)系，CD4+CD25+Treg表達水平變化是COPD患者免疫平衡的重要機制，也會影響機體炎性反應(yīng)和病情進展。

感染是AECOPD患者的常見影響因素[11]，符夢楠等[12]學(xué)者發(fā)現(xiàn)病原菌感染以革蘭氏陰性菌為主，與本研究結(jié)果一致。原因是，AECOPD患者以老年人為主，多數(shù)伴有其他基礎(chǔ)疾病，免疫功能低下，易出現(xiàn)腸道內(nèi)革蘭氏陰性菌過度增殖并發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，且革蘭陰性菌對呼吸道黏膜上皮黏附性較強[13]。COPD合并細菌感染會影響病情嚴重程度，干擾患者治療效果，延長其住院時間。本研究結(jié)果顯示，AECOPD患者中合并細菌感染者Treg細胞與相關(guān)細胞因子均和未合并感染者存在差異，尤其是革蘭氏陰性菌感染者，提示上述指標在預(yù)測細菌感染中的可行的。既往文獻證實，在合并有細菌等病原體感染的COPD中，細菌體裂解分解產(chǎn)物能夠促進巨噬細胞、肥大細胞分泌細胞因子，促使炎癥反應(yīng)加重[14-15]。革蘭陰性菌主要通過產(chǎn)生內(nèi)毒素致病[11]，可能與內(nèi)毒素誘導(dǎo)血清細胞因子水平較強有關(guān)。其中，IL-4和IFN-γ是預(yù)測COPD患者合并細菌感染的良好效能指標。與病原菌培養(yǎng)相比，血清學(xué)指標檢測更便捷，具有一定實際應(yīng)用價值，但也需更多研究進行驗證。

綜上所述，CD4+、CD4+CD25+Treg細胞表達與COPD發(fā)病、病情進展、細菌感染均存在關(guān)聯(lián)，不同病情嚴重程度COPD患者均有免疫功能失衡且會影響相關(guān)細胞因子水平，CD4+CD25+Treg相關(guān)細胞因子水平預(yù)測患者是否合并細胞感染效能良好。