郭業(yè)靜,裴彩霞,夏呈強,趙 燕,劉 強
(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,山西 太谷 030801)
母羊妊娠前后的生理變化與孕酮密切相關(guān),研究孕酮對瘤胃發(fā)酵和微生物區(qū)系的影響,對調(diào)控母羊瘤胃微生物代謝及提高飼料消化率具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn),妊娠會加快反芻動物瘤胃液和胃腸道飼料的通過率[1-4]。與非妊娠母羊相比,妊娠母羊瘤胃顆粒物的滯留時間和胃腸道平均滯留時間減少[5],營養(yǎng)物質(zhì)采食量逐漸升高。妊娠除影響動物代謝活動和營養(yǎng)需求外,還對動物腸道微生物菌群具有影響[6-7]。母體從妊娠早期到后期腸道中微生物菌群多樣性提高[6,8]。有研究發(fā)現(xiàn),孕婦腸道中變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)[6]和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)[7]豐度增加。奶牛產(chǎn)前和產(chǎn)后瘤胃中的普雷沃氏菌屬(Prevotella),瘤胃球菌科(unclassified Ruminococcaceae)未分類菌屬和琥珀酸弧菌科(unclassified Succinivibrionaceae)未分類菌屬相對豐度不同[9],瘤胃中微生物組成受妊娠影響,然而孕酮對瘤胃微生物的影響尚未見報道。
近年來,已證實宿主激素會影響細(xì)菌的基因表達(dá)[10],而這反過來又會對宿主產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)[11-12],性腺類固醇可抑制革蘭氏陽性菌的生長,孕酮作為調(diào)節(jié)和維持妊娠的重要激素[13],可促進(jìn)女性和小鼠腸道雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的生長[7]。此外,還有研究發(fā)現(xiàn),母羊妊娠后血清中孕酮濃度顯著升高[14],并可通過唾液和瘤胃壁進(jìn)入瘤胃[15],而瘤胃和瘤胃中的微生物在營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收過程中又發(fā)揮著關(guān)鍵作用,所以推測孕酮可能通過調(diào)控瘤胃微生物從而影響動物飼料分解。但到目前為止,孕酮對反芻動物瘤胃內(nèi)代謝活動的影響尚不清楚。
本試驗通過體外培養(yǎng)法,研究孕酮對綿羊瘤胃微生物發(fā)酵以及瘤胃微生物區(qū)系的影響,旨在為調(diào)控綿羊瘤胃微生物代謝提供新的思路。
1.1.1 試驗動物 選取3 只體況良好,非妊娠期的杜寒雜交經(jīng)產(chǎn)母羊(3~4 歲,體質(zhì)量為(50.00±1.28)kg),單欄飼喂,飼喂全混合日糧(TMR)(表1),每天于7:00 和19:00 喂食2 次,自由飲水。
表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平Tab.1 Composition and nutrient levels of the experimental diets %
1.1.2 發(fā)酵底物 TMR 風(fēng)干后,粉碎過2 mm 篩,作為發(fā)酵底物。
1.2.1 試驗設(shè)計 將5 mg 孕酮(Sigma,美國)溶解于100 mL 丙酮(分析純)中制備成原溶液。試驗設(shè)4 個處理,孕酮終質(zhì)量濃度分別為0 ng/mL(CK)、1 ng/mL(PL,低濃度組)、8 ng/mL(PM,中濃度組)和22 ng/mL(PH,高濃度組),每個處理5 次重復(fù),培養(yǎng)48 h 后終止發(fā)酵。
1.2.2 瘤胃液采集及體外發(fā)酵 瘤胃液按照MENKE 等[16]的方法進(jìn)行體外培養(yǎng)。晨飼前2 h 使用胃管采集3 只未妊娠母羊的瘤胃液,混勻過濾后裝入充滿CO2的保溫瓶(39 ℃),迅速帶回實驗室。每個發(fā)酵管中使用300 mg 風(fēng)干的TMR 和30 mL培養(yǎng)液(10 mL 瘤胃液和20 mL 緩沖液)并加入不同水平的孕酮,置于39 ℃恒溫水浴振蕩器中發(fā)酵培養(yǎng)。
1.2.3 樣品采集 根據(jù)BLüMMEL 等[17]的方法,在培養(yǎng)3、6、9、12、20、28、36、48 h 時記錄氣體體積。培養(yǎng)結(jié)束后,取2 mL 上清液于-80 ℃貯存,進(jìn)行瘤胃微生物菌群測定。剩余上清液用定量濾紙分離后,立即用pH 計(EC-pH510 標(biāo)準(zhǔn)智能型臺式pH計,上海)測定pH 值,于-80 ℃貯存,以測定瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸和氨態(tài)氮(NH3-N)的含量。
1.3.1 體外發(fā)酵參數(shù) 揮發(fā)性脂肪酸采用TRACE-1300 氣相色譜儀(Thermo Fisher Scientific,美國)測定;采用紫外分光光度計(UV2100,上海)測定瘤胃液中NH3-N 濃度;采用動態(tài)發(fā)酵參數(shù)模型計算產(chǎn)氣參數(shù)[18];根據(jù)MENKE 等[19]的方法估算飼料代謝能(ME)和發(fā)酵24 h 后有機物消化率(OMD)。
其中,d為飼料粗蛋白含量(g/kg),f為飼料粗脂肪含量(g/kg),h為飼料粗灰分含量(g/kg)。
1.3.2 瘤胃培養(yǎng)液DNA 提取和16S rRNA 基因測序 取等量的同一孕酮質(zhì)量濃度樣品上清液混合為一個樣品,通過珠磨法從上清液混合物中提取微生物DNA[20]。并對16S rRNA 基因的V3-V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴增[21]。
PCR 擴增產(chǎn)物在Illumina MiSeq 平臺(華大基因,深圳)上測序。序列進(jìn)行質(zhì)控和過濾后,將得到的平均優(yōu)質(zhì)序列使用USEARCH(Version 7.0.1090)按照相似度大于0.97 將序列聚類為操作分類單元。Alpha(ACE、Chao1、Simpson 和Shannon 指 數(shù))和Beta 多樣性(主坐標(biāo)分析)通過Microbiome Analyst(https://www.microbiomeanalyst.ca/MicrobiomeA nalyst/upload/OtuUploadView.xhtml)進(jìn)行估算。采 用LEfSe(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)分析CK 與孕酮添加組之間的菌群差異。
數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進(jìn)行初步整理;使用SPSS 21.0 中一般線性模型進(jìn)行差異性分析,采用LSD 和Duncan 氏法進(jìn)行多重比較(P<0.01 表示差異極顯著,P<0.05 表示差異顯著)。
孕酮對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響如表2 所示。
表2 孕酮對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Tab.2 Effect of progesterone on rumen fermentation parameters
由表2 可知,CK、PL 組、PM 組和PH 組之間總揮發(fā)性脂肪酸濃度無差異;與CK 相比,PH 組乙酸比例顯著降低1.77%(P<0.05),PM 組丁酸比例顯著升高6.10%(P<0.05),異丁酸比例極顯著升高7.95%(P<0.01),PL 組、PM 組和PH 組異戊酸比例均顯著升高(P<0.05);PL 組丙酸比例顯著低于PM 組(P<0.05),極顯著低于PH 組(P<0.01)。PL 組的乙酸與丙酸之比顯著高于PM 組和PH 組(P<0.05);PL 組 的GP24、OMD 和ME顯著高于CK(P<0.05),極顯著高于PH 組(P<0.01);PL 組的GPFF 最高,顯著高于CK 和PM 組(P<0.05),極顯著高于PH 組(P<0.01)。CK 和孕酮添加組之間NH3-N 濃度、pH、GP48和RGP 無顯著差異。
由表3 可知,ACE 指數(shù)和Chaol 指數(shù)在CK、PL組、PM 組和PH 組之間差異不顯著;PH 組Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)極顯著低于其他3組(P<0.01)。以上結(jié)果表明,孕酮對細(xì)菌群落的豐富度無顯著影響,但高濃度的孕酮可降低微生物菌群多樣性。
表3 孕酮對瘤胃微生物菌群Alpha 多樣性的影響Tab.3 Effect of progesterone on Alpha diversity of rumen microflora
孕酮對瘤胃微生物菌群Beta 多樣性的影響如圖1 所示。
圖1 孕酮對瘤胃微生物菌群Beta 多樣性的影響Fig.1 Effect of progesterone on Beta diversity of rumen microflora
通過非加權(quán)Unifrac 距離主坐標(biāo)分析圖可知(圖1),第1 主成分(貢獻(xiàn)率為55.6%)中PM 組與CK 和PL 組微生物菌群多樣性的差異較大,而PH組和其他3 組組間分布距離較遠(yuǎn),說明PH 組和其他3 組組間的微生物菌群多樣性差異顯著(P<0.05)。
由圖2可知,與CK 相比,孕酮添加組β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、Elusimicrobia菌綱、伯克氏菌目(Burkholderiales)、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae),Elusimicrobiaceae菌科、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)和Elusimicrobium菌屬的相對豐度顯著升高(P<0.05);孕酮添加組顯著降低了動性球菌科(Planococcaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)和互養(yǎng)菌科(Synergistaceae)的相對豐度。此外,孕酮添加組中假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)、反芻桿菌屬(Ruminobacter)、Streptococcus minor、Shuttleworthia菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonas)和乳桿菌屬(Lactobacillus)的相對豐度也顯著降低(P<0.05)。
圖2 CK 和孕酮添加組瘤胃微生物菌群LEfSe 分析Fig.2 LEfSe analysis of rumen microflora in CK and progesterone addition groups
瘤胃作為反芻動物極其重要的消化器官,其消化代謝能力和微生物區(qū)系變化受動物生理狀態(tài)的影響。孕酮是維持妊娠的關(guān)鍵激素[13],其濃度在瘤胃中呈晝夜變化規(guī)律[22],瘤胃中孕酮直接或間接地參與了瘤胃發(fā)酵與微生物區(qū)系的調(diào)控。
揮發(fā)性脂肪酸是瘤胃微生物發(fā)酵飼料底物中碳水化合物產(chǎn)生的重要代謝產(chǎn)物,可以評價瘤胃微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用程度[23]。本試驗中,孕酮質(zhì)量濃度從0 ng/mL 增加到22 ng/mL 時,乙酸比例呈現(xiàn)下降趨勢,丙酸比例先降低后升高,乙酸丙酸之比先升高后降低。同時,本研究還發(fā)現(xiàn),孕酮添加組中的琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)[24](屬于變形菌門(Proteobacteria))、乳桿菌屬(Lactobacillus)[25]、假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)[26]、Shuttleworthia菌屬[27](屬于厚壁菌門(Firmicutes))和反芻桿菌屬(Ruminobacter)[28](屬于變形菌門(Proteobacteria))相對豐度降低,而這些細(xì)菌只產(chǎn)乙酸,不產(chǎn)丙酸。推測孕酮可能通過抑制這些細(xì)菌的代謝增殖,進(jìn)而抑制了乙酸的生成。前人研究發(fā)現(xiàn),孕酮可以提高瘤胃中總揮發(fā)性脂肪酸的含量[22,29],而本試驗卻發(fā)現(xiàn),孕酮對瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸濃度無影響,這可能是由于發(fā)酵時間、發(fā)酵底物或瘤胃液供體動物不同,其還有待進(jìn)一步研究。
瘤胃液pH 是反映瘤胃內(nèi)環(huán)境與發(fā)酵水平的一項綜合指標(biāo)[30]。本試驗發(fā)現(xiàn),添加孕酮對瘤胃pH無影響,這與任清長[22]的研究結(jié)果一致。但由于發(fā)酵液中緩沖液占比較大,本試驗中各組pH 值均在正常范圍(5.5~7.5),可保證微生物的正常生長和繁殖。瘤胃氨態(tài)氮濃度受瘤胃對蛋白質(zhì)降解程度及微生物對氨態(tài)氮利用情況的影響[31]。本試驗發(fā)現(xiàn),添加孕酮對瘤胃氨態(tài)氮濃度無影響。但是,陳杰[29]通過人工瘤胃試驗發(fā)現(xiàn),孕酮可提高瘤胃微生物的代謝活性并促進(jìn)氨態(tài)氮的釋放。本試驗各組之間氨態(tài)氮濃度變化不大的原因,可能是由于發(fā)酵底物的成分和比例相同。
本研究發(fā)現(xiàn),孕酮質(zhì)量濃度可調(diào)控瘤胃微生物區(qū)系的變化;隨著孕酮質(zhì)量濃度的升高,細(xì)菌多樣性呈依次遞減的趨勢,瘤胃菌群的結(jié)構(gòu)差異也隨之增大。然而,孕酮質(zhì)量濃度對物種的豐富度無影響。NURIEL-OHAYON 等[7]將孕酮 或PBS 加 入雌性小鼠的糞漿中,通過未加權(quán)UniFrac 測定發(fā)現(xiàn),孕酮處理組微生物組成多樣性明顯降低,與本試驗結(jié)果一致。YOTIS 等[12]在體外檢測了孕酮對革蘭氏陽性菌活性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),孕酮對革蘭氏陰性菌的抑制作用很小。眾所周知,瘤胃中存在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌,孕酮可能參與了對瘤胃中革蘭氏陽性菌的抑制作用。NURIELOHAYON 等[7]研究也發(fā)現(xiàn),孕酮處理期間,糞球菌屬(Coprococcus)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、韋榮氏球菌屬(Veillonella)、薩特氏菌屬(Sutterella)和乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度增加,本試驗結(jié)果與其不一致,可能是由于所處理的樣品或孕酮添加量不同。
一定時間內(nèi)的產(chǎn)氣量反映了底物被瘤胃微生物利用的程度。黃雅莉等[32]研究報道,產(chǎn)氣量與飼料中有機物的降解程度呈正相關(guān),并且可消化的有機物含量和代謝能與24 h 累積產(chǎn)氣量成正比。任清長[22]研究發(fā)現(xiàn),在高淀粉日糧條件下,培養(yǎng)液孕酮質(zhì)量濃度為2 ng/mL 時,發(fā)酵72 h 后產(chǎn)氣量高于對照組。本試驗中,隨著孕酮質(zhì)量濃度升高,潛在最大產(chǎn)氣量、發(fā)酵24 h 產(chǎn)氣量、有機物消化率以及飼料代謝能均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,且在孕酮質(zhì)量濃度為1 ng/mL 時最高,說明此質(zhì)量濃度下飼料底物能被微生物很好地利用,但在質(zhì)量濃度為22 ng/mL 時最低,可能是由于高質(zhì)量濃度孕酮抑制了瘤胃微生物活性,從而導(dǎo)致產(chǎn)氣量、有機物降解率下降。本試驗孕酮影響瘤胃微生物代謝的作用機制還需進(jìn)一步驗證。
綜上所述,孕酮質(zhì)量濃度會影響瘤胃發(fā)酵和瘤胃微生物菌群,且孕酮質(zhì)量濃度為22 ng/mL 時瘤胃菌群多樣性降低。