郭業(yè)靜，裴彩霞，夏呈強，趙 燕，劉 強

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

母羊妊娠前后的生理變化與孕酮密切相關(guān)，研究孕酮對瘤胃發(fā)酵和微生物區(qū)系的影響，對調(diào)控母羊瘤胃微生物代謝及提高飼料消化率具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠會加快反芻動物瘤胃液和胃腸道飼料的通過率[1-4]。與非妊娠母羊相比，妊娠母羊瘤胃顆粒物的滯留時間和胃腸道平均滯留時間減少[5]，營養(yǎng)物質(zhì)采食量逐漸升高。妊娠除影響動物代謝活動和營養(yǎng)需求外，還對動物腸道微生物菌群具有影響[6-7]。母體從妊娠早期到后期腸道中微生物菌群多樣性提高[6,8]。有研究發(fā)現(xiàn)，孕婦腸道中變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）[6]和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）[7]豐度增加。奶牛產(chǎn)前和產(chǎn)后瘤胃中的普雷沃氏菌屬（Prevotella），瘤胃球菌科（unclassified Ruminococcaceae）未分類菌屬和琥珀酸弧菌科（unclassified Succinivibrionaceae）未分類菌屬相對豐度不同[9]，瘤胃中微生物組成受妊娠影響，然而孕酮對瘤胃微生物的影響尚未見報道。

近年來，已證實宿主激素會影響細菌的基因表達[10]，而這反過來又會對宿主產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，性腺類固醇可抑制革蘭氏陽性菌的生長，孕酮作為調(diào)節(jié)和維持妊娠的重要激素[13]，可促進女性和小鼠腸道雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的生長[7]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，母羊妊娠后血清中孕酮濃度顯著升高[14]，并可通過唾液和瘤胃壁進入瘤胃[15]，而瘤胃和瘤胃中的微生物在營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收過程中又發(fā)揮著關(guān)鍵作用，所以推測孕酮可能通過調(diào)控瘤胃微生物從而影響動物飼料分解。但到目前為止，孕酮對反芻動物瘤胃內(nèi)代謝活動的影響尚不清楚。

本試驗通過體外培養(yǎng)法，研究孕酮對綿羊瘤胃微生物發(fā)酵以及瘤胃微生物區(qū)系的影響，旨在為調(diào)控綿羊瘤胃微生物代謝提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 選取3 只體況良好，非妊娠期的杜寒雜交經(jīng)產(chǎn)母羊（3～4 歲，體質(zhì)量為（50.00±1.28）kg），單欄飼喂，飼喂全混合日糧（TMR）（表1），每天于7:00 和19:00 喂食2 次，自由飲水。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平Tab.1 Composition and nutrient levels of the experimental diets %

1.1.2 發(fā)酵底物 TMR 風(fēng)干后，粉碎過2 mm 篩，作為發(fā)酵底物。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 將5 mg 孕酮（Sigma，美國）溶解于100 mL 丙酮（分析純）中制備成原溶液。試驗設(shè)4 個處理，孕酮終質(zhì)量濃度分別為0 ng/mL（CK）、1 ng/mL（PL，低濃度組）、8 ng/mL（PM，中濃度組）和22 ng/mL（PH，高濃度組），每個處理5 次重復(fù)，培養(yǎng)48 h 后終止發(fā)酵。

1.2.2 瘤胃液采集及體外發(fā)酵 瘤胃液按照MENKE 等[16]的方法進行體外培養(yǎng)。晨飼前2 h 使用胃管采集3 只未妊娠母羊的瘤胃液，混勻過濾后裝入充滿CO2的保溫瓶（39 ℃），迅速帶回實驗室。每個發(fā)酵管中使用300 mg 風(fēng)干的TMR 和30 mL培養(yǎng)液（10 mL 瘤胃液和20 mL 緩沖液）并加入不同水平的孕酮，置于39 ℃恒溫水浴振蕩器中發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.3 樣品采集 根據(jù)BLüMMEL 等[17]的方法，在培養(yǎng)3、6、9、12、20、28、36、48 h 時記錄氣體體積。培養(yǎng)結(jié)束后，取2 mL 上清液于-80 ℃貯存，進行瘤胃微生物菌群測定。剩余上清液用定量濾紙分離后，立即用pH 計（EC-pH510 標(biāo)準(zhǔn)智能型臺式pH計，上海）測定pH 值，于-80 ℃貯存，以測定瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸和氨態(tài)氮（NH3-N）的含量。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 體外發(fā)酵參數(shù) 揮發(fā)性脂肪酸采用TRACE-1300 氣相色譜儀（Thermo Fisher Scientific，美國）測定；采用紫外分光光度計（UV2100,上海）測定瘤胃液中NH3-N 濃度；采用動態(tài)發(fā)酵參數(shù)模型計算產(chǎn)氣參數(shù)[18]；根據(jù)MENKE 等[19]的方法估算飼料代謝能（ME）和發(fā)酵24 h 后有機物消化率（OMD）。

其中，d為飼料粗蛋白含量（g/kg），f為飼料粗脂肪含量（g/kg），h為飼料粗灰分含量（g/kg）。

1.3.2 瘤胃培養(yǎng)液DNA 提取和16S rRNA 基因測序 取等量的同一孕酮質(zhì)量濃度樣品上清液混合為一個樣品，通過珠磨法從上清液混合物中提取微生物DNA[20]。并對16S rRNA 基因的V3-V4 可變區(qū)進行PCR 擴增[21]。

PCR 擴增產(chǎn)物在Illumina MiSeq 平臺（華大基因，深圳）上測序。序列進行質(zhì)控和過濾后，將得到的平均優(yōu)質(zhì)序列使用USEARCH（Version 7.0.1090）按照相似度大于0.97 將序列聚類為操作分類單元。Alpha（ACE、Chao1、Simpson 和Shannon 指 數(shù)）和Beta 多樣性（主坐標(biāo)分析）通過Microbiome Analyst（https://www.microbiomeanalyst.ca/MicrobiomeA nalyst/upload/OtuUploadView.xhtml）進行估算。采 用LEfSe（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）分析CK 與孕酮添加組之間的菌群差異。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進行初步整理；使用SPSS 21.0 中一般線性模型進行差異性分析，采用LSD 和Duncan 氏法進行多重比較（P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 孕酮對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

孕酮對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響如表2 所示。

表2 孕酮對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Tab.2 Effect of progesterone on rumen fermentation parameters

由表2 可知，CK、PL 組、PM 組和PH 組之間總揮發(fā)性脂肪酸濃度無差異；與CK 相比，PH 組乙酸比例顯著降低1.77%（P＜0.05），PM 組丁酸比例顯著升高6.10%（P＜0.05），異丁酸比例極顯著升高7.95%（P＜0.01），PL 組、PM 組和PH 組異戊酸比例均顯著升高（P＜0.05）；PL 組丙酸比例顯著低于PM 組（P＜0.05），極顯著低于PH 組（P＜0.01）。PL 組的乙酸與丙酸之比顯著高于PM 組和PH 組（P＜0.05）；PL 組 的GP24、OMD 和ME顯著高于CK（P＜0.05），極顯著高于PH 組（P＜0.01）；PL 組的GPFF 最高，顯著高于CK 和PM 組（P＜0.05），極顯著高于PH 組（P＜0.01）。CK 和孕酮添加組之間NH3-N 濃度、pH、GP48和RGP 無顯著差異。

2.2 孕酮對瘤胃微生物區(qū)系A(chǔ)lpha 多樣性的影響

由表3 可知，ACE 指數(shù)和Chaol 指數(shù)在CK、PL組、PM 組和PH 組之間差異不顯著；PH 組Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)極顯著低于其他3組（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，孕酮對細菌群落的豐富度無顯著影響，但高濃度的孕酮可降低微生物菌群多樣性。

表3 孕酮對瘤胃微生物菌群Alpha 多樣性的影響Tab.3 Effect of progesterone on Alpha diversity of rumen microflora

2.3 孕酮對瘤胃微生物區(qū)系Beta 多樣性的影響

孕酮對瘤胃微生物菌群Beta 多樣性的影響如圖1 所示。

圖1 孕酮對瘤胃微生物菌群Beta 多樣性的影響Fig.1 Effect of progesterone on Beta diversity of rumen microflora

通過非加權(quán)Unifrac 距離主坐標(biāo)分析圖可知（圖1），第1 主成分（貢獻率為55.6%）中PM 組與CK 和PL 組微生物菌群多樣性的差異較大，而PH組和其他3 組組間分布距離較遠，說明PH 組和其他3 組組間的微生物菌群多樣性差異顯著（P＜0.05）。

2.4 瘤胃微生物菌群LEfse 分析結(jié)果

由圖2可知，與CK 相比，孕酮添加組β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、Elusimicrobia菌綱、伯克氏菌目（Burkholderiales）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae），Elusimicrobiaceae菌科、黏膠球形菌門（Lentisphaerae）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）和Elusimicrobium菌屬的相對豐度顯著升高（P＜0.05）；孕酮添加組顯著降低了動性球菌科（Planococcaceae）、擬桿菌科（Bacteroidaceae）、琥珀酸弧菌科（Succinivibrionaceae）和互養(yǎng)菌科（Synergistaceae）的相對豐度。此外，孕酮添加組中假丁酸弧菌屬（Pseudobutyrivibrio）、反芻桿菌屬（Ruminobacter）、Streptococcus minor、Shuttleworthia菌屬、假單胞菌屬（Pseudomonas）和乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度也顯著降低（P＜0.05）。

圖2 CK 和孕酮添加組瘤胃微生物菌群LEfSe 分析Fig.2 LEfSe analysis of rumen microflora in CK and progesterone addition groups

3 結(jié)論與討論

瘤胃作為反芻動物極其重要的消化器官，其消化代謝能力和微生物區(qū)系變化受動物生理狀態(tài)的影響。孕酮是維持妊娠的關(guān)鍵激素[13]，其濃度在瘤胃中呈晝夜變化規(guī)律[22]，瘤胃中孕酮直接或間接地參與了瘤胃發(fā)酵與微生物區(qū)系的調(diào)控。

揮發(fā)性脂肪酸是瘤胃微生物發(fā)酵飼料底物中碳水化合物產(chǎn)生的重要代謝產(chǎn)物，可以評價瘤胃微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用程度[23]。本試驗中，孕酮質(zhì)量濃度從0 ng/mL 增加到22 ng/mL 時，乙酸比例呈現(xiàn)下降趨勢，丙酸比例先降低后升高，乙酸丙酸之比先升高后降低。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，孕酮添加組中的琥珀酸弧菌科（Succinivibrionaceae）[24]（屬于變形菌門（Proteobacteria））、乳桿菌屬（Lactobacillus）[25]、假丁酸弧菌屬（Pseudobutyrivibrio）[26]、Shuttleworthia菌屬[27]（屬于厚壁菌門（Firmicutes））和反芻桿菌屬（Ruminobacter）[28]（屬于變形菌門（Proteobacteria））相對豐度降低，而這些細菌只產(chǎn)乙酸，不產(chǎn)丙酸。推測孕酮可能通過抑制這些細菌的代謝增殖，進而抑制了乙酸的生成。前人研究發(fā)現(xiàn)，孕酮可以提高瘤胃中總揮發(fā)性脂肪酸的含量[22,29]，而本試驗卻發(fā)現(xiàn)，孕酮對瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸濃度無影響，這可能是由于發(fā)酵時間、發(fā)酵底物或瘤胃液供體動物不同，其還有待進一步研究。

瘤胃液pH 是反映瘤胃內(nèi)環(huán)境與發(fā)酵水平的一項綜合指標(biāo)[30]。本試驗發(fā)現(xiàn)，添加孕酮對瘤胃pH無影響，這與任清長[22]的研究結(jié)果一致。但由于發(fā)酵液中緩沖液占比較大，本試驗中各組pH 值均在正常范圍（5.5～7.5），可保證微生物的正常生長和繁殖。瘤胃氨態(tài)氮濃度受瘤胃對蛋白質(zhì)降解程度及微生物對氨態(tài)氮利用情況的影響[31]。本試驗發(fā)現(xiàn)，添加孕酮對瘤胃氨態(tài)氮濃度無影響。但是，陳杰[29]通過人工瘤胃試驗發(fā)現(xiàn)，孕酮可提高瘤胃微生物的代謝活性并促進氨態(tài)氮的釋放。本試驗各組之間氨態(tài)氮濃度變化不大的原因，可能是由于發(fā)酵底物的成分和比例相同。

本研究發(fā)現(xiàn)，孕酮質(zhì)量濃度可調(diào)控瘤胃微生物區(qū)系的變化；隨著孕酮質(zhì)量濃度的升高，細菌多樣性呈依次遞減的趨勢，瘤胃菌群的結(jié)構(gòu)差異也隨之增大。然而，孕酮質(zhì)量濃度對物種的豐富度無影響。NURIEL-OHAYON 等[7]將孕酮 或PBS 加 入雌性小鼠的糞漿中，通過未加權(quán)UniFrac 測定發(fā)現(xiàn)，孕酮處理組微生物組成多樣性明顯降低，與本試驗結(jié)果一致。YOTIS 等[12]在體外檢測了孕酮對革蘭氏陽性菌活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孕酮對革蘭氏陰性菌的抑制作用很小。眾所周知，瘤胃中存在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，孕酮可能參與了對瘤胃中革蘭氏陽性菌的抑制作用。NURIELOHAYON 等[7]研究也發(fā)現(xiàn)，孕酮處理期間，糞球菌屬（Coprococcus）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、韋榮氏球菌屬（Veillonella）、薩特氏菌屬（Sutterella）和乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度增加，本試驗結(jié)果與其不一致，可能是由于所處理的樣品或孕酮添加量不同。

一定時間內(nèi)的產(chǎn)氣量反映了底物被瘤胃微生物利用的程度。黃雅莉等[32]研究報道，產(chǎn)氣量與飼料中有機物的降解程度呈正相關(guān)，并且可消化的有機物含量和代謝能與24 h 累積產(chǎn)氣量成正比。任清長[22]研究發(fā)現(xiàn)，在高淀粉日糧條件下，培養(yǎng)液孕酮質(zhì)量濃度為2 ng/mL 時，發(fā)酵72 h 后產(chǎn)氣量高于對照組。本試驗中，隨著孕酮質(zhì)量濃度升高，潛在最大產(chǎn)氣量、發(fā)酵24 h 產(chǎn)氣量、有機物消化率以及飼料代謝能均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且在孕酮質(zhì)量濃度為1 ng/mL 時最高，說明此質(zhì)量濃度下飼料底物能被微生物很好地利用，但在質(zhì)量濃度為22 ng/mL 時最低，可能是由于高質(zhì)量濃度孕酮抑制了瘤胃微生物活性，從而導(dǎo)致產(chǎn)氣量、有機物降解率下降。本試驗孕酮影響瘤胃微生物代謝的作用機制還需進一步驗證。

綜上所述，孕酮質(zhì)量濃度會影響瘤胃發(fā)酵和瘤胃微生物菌群，且孕酮質(zhì)量濃度為22 ng/mL 時瘤胃菌群多樣性降低。