陳 闊，歐陽英，何天翔，盧煒琪，尹樂斌

（邵陽學院食品與化學工程學院，湖南邵陽 422000）

大曲的主要原料是小麥，形狀類似磚塊，具有豐富的菌系和酶系，是一種釀酒用的糖化劑及發(fā)酵劑，且含有多種能水解和發(fā)酵底物的產(chǎn)酶微生物。釀酒的主要原料由高粱、小麥、玉米等組成，其中含有大量淀粉，淀粉是自然界中的第二大多糖儲備物質(zhì)，是許多食品與非食品行業(yè)的重要組成部分[1]。大曲中能產(chǎn)生淀粉酶的微生物有霉菌、酵母菌、青霉菌和細菌等，其中淀粉酶已被廣泛運用于釀酒、紡織與烘焙等行業(yè)生產(chǎn)，除動物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外兩大來源是植物和微生物[2]。

為解決釀酒過程中淀粉漿液化糖化中的調(diào)溫度與調(diào)節(jié)pH 等步驟，本文通過考察形態(tài)學、生理生化特性，利用液體發(fā)酵法對產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)基發(fā)酵條件進行優(yōu)化，從邵陽大曲中篩選出了一株耐酸、高產(chǎn)淀粉酶的酵母菌。而在不同的地域制備的大曲，其微生物多樣性可能存在不同。張雙燕[3]利用MiSeq 高通量技術(shù)分析北京地域的清香型大曲微生物多樣性，得出真菌中的優(yōu)勢菌是假絲酵母、曲霉屬等。胡曉龍[4]使用同樣的方法對河南省地域的大曲微生物群落多樣性進行分析，得出真菌中優(yōu)勢菌種是扣囊復膜酵母、雪黃散囊菌等。由此得出不同地域的氣候、地勢環(huán)境、大曲制作方法的不同均可能對大曲中微生物的多樣性產(chǎn)生影響。對于白酒行業(yè)來說，篩選出具有地域特色的高品質(zhì)微生物能提升出酒率和酒的品質(zhì)，進而改善傳統(tǒng)制曲工藝。故此，對湖南邵陽地區(qū)的大曲微生物的篩選與研究顯得極為必要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

湖南省邵陽市湘窖酒業(yè)有限公司高溫包包曲。

1.1.2 主要培養(yǎng)基與試劑

（1）培養(yǎng)基。①初始發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、自來水1 L、pH 值7.0，121 ℃滅菌25 min。②初選培養(yǎng)基：玉米淀粉20 g、K2HPO41.0 g、NaNO33 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊 脂 粉13 g、氯 霉 素0.005 g、定容至1 L 錐形瓶中，pH 值 5.5 ～6.0，121 ℃滅菌25 min。③馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。④YEPD 培養(yǎng)基：酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL，115 ℃濕熱滅菌20 min。

（2）試劑。硝酸鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、麥芽糖、3,5-二硝基水楊酸、酵母膏和瓊脂粉等由邵陽學院生化實驗室提供；氯霉素購于藥店。

1.1.3 主要儀器設備

LE438 型pH 計：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DH-420 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；UV-3802 型紫外分光光度計：重慶萬達儀器有限公司；H21-6 型電熱恒溫水浴鍋：北京市東霞電子儀表廠；JI54DWS 型高壓蒸汽滅菌鍋：致微廈門儀器有限公司等。

1.2 試驗方法

1.2.1 大曲發(fā)酵

取1 g大曲接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，40 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株初篩

取發(fā)酵培養(yǎng)液1 mL，于99 mL 的無菌水三角瓶中，振蕩均勻，即為稀釋度10-2的粉末懸液。再依次進行梯度稀釋，獲得稀釋度為10-3、10-4、10-5和10-6的大曲稀釋液。分別取10-4、10-5、10-6稀釋液0.1 mL 涂布于篩選平板上，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。挑取培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落進行平板劃線，得到單個菌落。噴灑碘液，若菌落出現(xiàn)白色透明圈，則說明此菌可產(chǎn)生淀粉酶，挑選有透明圈的菌落備用，并制作表格統(tǒng)計D/d值，初步篩選產(chǎn)淀粉酶菌株。

1.2.3 菌株復篩

高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選：將初篩出的純菌種接種于250 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min 搖床培養(yǎng)2 d。取發(fā)酵液1 mL 于8 000 r/min 下離心10 min，取上清液測酶活力，每個樣品重復3 次，結(jié)果取平均值。

1.2.4 耐酸性篩選

將篩選出的兩株高產(chǎn)性菌株分別同時接種于YPED 液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)1 d，種子活化液濃度為1.0×107CFU/mL，設置5 個不同梯度的pH值，pH 分別為2.5、3.0、3.5、4.0 和4.5，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，吸取2×105CFU/mL 菌液1 mL 于上述不同pH 值的100 mL YPED 液體培養(yǎng)基中，利用紫外分光光度計測定560 nm 下菌液的OD值，OD值越大，菌株的耐酸性越強[5-6]。

1.2.5 酶活測定方法

（1）測定方法。采用DNS 法[7]測菌株的酶活力，以麥芽糖繪制標準曲線，測定試驗菌株在520 nm 的吸光度。

（2）標準曲線的繪制。①取16 支潔凈比色管分別編號1、2、3、4、5 和6（除6 號試管1 支外，其他每組編號各3 支），用蒸餾水沖洗，于培養(yǎng)箱中烘干，之后分別往比色管中依次加入0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL 和2.0 mL 麥芽糖標準溶液，DNS指示劑，蒸餾水（加入量參考文獻[8])。②搖勻后于沸水中加熱5 min，冷卻后，各試管用蒸餾水定容至25 mL，試管6 作為對照組，其他組平行試驗3 次且結(jié)果取平均值。③測定試驗菌株在520 nm的吸光度，以麥芽糖量為橫坐標，吸光光度值為縱坐標，得到麥芽糖含量的回歸方程。

（3）酶活力單位定義。在40 ℃、pH 值 6.0 的條件下，每分鐘從1%的可溶性淀粉中釋放出1 mmol麥芽糖的酶量定義為1 個酶活力單位（U）[9]。

1.2.6 菌落形態(tài)觀察

將初篩后的菌株平板劃線，純化，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，用美藍與棉藍溶液分別對酵母菌與霉菌進行鏡檢。觀察平板中菌落的顏色、大小、表面的粗糙程度、鏡檢下的孢子形態(tài)以及菌株菌絲狀態(tài)等，并且參照《真菌鑒定手冊》[10]進行比較。

1.2.7 菌株生物學特性測定

（1）溫度對菌株產(chǎn)淀粉酶能力的影響。將待測菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃和40 ℃ 5 個溫度下培養(yǎng)，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)2 d，取2 mL 酶液進行酶活性測定。每組設3個平行樣，每個樣品重復3 次，結(jié)果取平均值[11]。

（2）酒精濃度對菌株產(chǎn)淀粉酶能力的影響。以5%的菌液種量接種到酒精濃度為2%、4%、6%、8%和10%的高粱汁培養(yǎng)基中，在28 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)2 ～3 d，取2 mL 酶液進行酶活性測定。每組設3 個平行樣，每個樣品重復3 次，結(jié)果取平均值。

（3）酸堿度對菌株產(chǎn)淀粉酶的影響。以5%的菌液接種量接種到pH 值 2.5、pH 值 3.0、pH 值 3.5、pH 值 4.0 和pH 值 4.5 的高粱汁培養(yǎng)基中，在28 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)2 ～3 d，取2 mL 酶液進行酶活性測定。每組設3 個平行樣，每個樣品重復3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐酸、高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選結(jié)果

2.1.1 淀粉酶標準曲線繪制

淀粉酶標準曲線見圖1，該方程為y=0.268 9x+0.0565 5，R2=0.991 9。

圖1 淀粉酶標準曲線

2.1.2 高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

從大曲中初篩分離得13 株菌株，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色與菌落形態(tài)，初步觀察判定為酵母菌、毛霉、青霉與黃曲霉，因黃曲霉會產(chǎn)生黃曲霉毒素，其是一類有毒的次生代謝產(chǎn)物，且廣泛存在于農(nóng)作物及食物中，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構(gòu)劃定為“Ⅰ”類致癌物，故復篩時將黃曲霉剔除，選取酵母菌、毛霉與青霉中透明圈直徑與菌落直徑較大的3 株菌株進行復篩，測定其酶活性[12]。由表1 可知，WB4與WB9 的酶活性最高，說明這兩株菌株的產(chǎn)酶能力較好。

表1 高產(chǎn)淀粉酶的篩選

2.1.3 耐酸淀粉酶的篩選

將WB4 與WB9 分別接種于pH 為2.5、3.0、3.5、4.0 和4.5 的YEPD 培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)3 d。由表2 可知，在波長560 nm 下，且pH 在2.5 ～4.5，隨著pH的變化，WB4 與WB9 的OD值至均高于前一梯度的OD值。傳統(tǒng)釀酒工藝中，在糖化之前需將醪液pH值由6.5 降到4.5，以便糖化酶活性的最大化。因pH在4.5 的條件下，WB4 的酶活性更高，故WB4 即為所要篩選耐酸、高產(chǎn)淀粉酶微生物。耐酸性以及酶活結(jié)果如表2 所示。

表2 耐酸淀粉酶的OD 值測定以及酶活計算

2.2 產(chǎn)淀粉酶菌株形態(tài)學鑒定

從初選培養(yǎng)基中分離出3 種不同形態(tài)的菌株，再進行純化，觀察菌落形態(tài)與孢子特征，如圖2 所示。由圖2 可知，在28 ℃條件下，將菌株WB4、WB9、WB13 培養(yǎng)3 d，其中WB4 與WB13 菌落呈乳白色，表面呈圓形且凸起，菌落較小，邊緣較為規(guī)則，菌落中單個細胞寬度約2 ～3 nm，長度5 ～6 nm，呈橢圓形，初步鑒定該菌株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。WB9 菌落呈雪白色，表面黏稠、濕潤，邊緣不規(guī)整，菌落較大，菌落中單個細胞直徑約2 ～3 nm，呈卵圓狀，初步鑒定為粉狀米勒酵母（Millerozy mafarinose）。實驗菌株形態(tài)特征與《真菌鑒定手冊》和文獻[13]鑒定結(jié)果一致。

圖2 菌株WB4、WB9、WB13 菌落及分生孢子形態(tài)特征

2.3 菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 溫度對菌株WB4 產(chǎn)淀粉酶能力的影響

將菌株分別在24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃與40 ℃ 5個溫度下培養(yǎng)2 d后，用DNS法測定其酶活性，結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，菌株WB4 在32 ℃時，酶活性最高，平均OD值為2.877；當溫度低于32 ℃時，菌株的酶活性相較之下較低；當溫度高于32 ℃時，酶活性顯著降低。因此，確定菌株WB4 的最適溫度為32 ℃。

圖3 WB4 的最適溫度圖

2.3.2 酒精濃度對菌株WB4 產(chǎn)淀粉酶能力的影響

將WB4的種子液加入含有100 mL的酒精濃度為2%、4%、6%、8%和10%的高粱汁培養(yǎng)基的錐形瓶中，貼好標簽，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 ～3 d后，用DNS 法測定其酶活性，結(jié)果如圖4 所示。由圖4 可知，當酒精濃度在2%～8%時，WB4 菌的OD值是緩慢下降，但酒精濃度在8%～10%時，WB4 的OD值下降較快。因此，WB4 菌株的耐酒精濃度為10%。

圖4 WB4 對酒精濃度的耐受性測定圖

3 結(jié)論

本研究從湖南省湘窖酒業(yè)有限公司中高溫包包曲中篩選出13 株產(chǎn)淀粉酶的菌株，并對這13 株菌株進行初步的形態(tài)學觀察，判定為酵母菌、毛霉、青霉與黃曲霉4 種菌株，因為黃曲霉會產(chǎn)生黃曲霉毒素，故不進行后續(xù)操作；其他菌株通過酶活性大小鑒定，得WB4 與WB9 這兩株菌株的產(chǎn)淀粉酶能力較強；將WB4 與WB9 這兩株菌株接種于YPED液體培養(yǎng)基中，再通過DNS 法對其進行酶活性大小比較，最終獲得一株耐酸、高產(chǎn)淀粉酶菌株WB4；經(jīng)過形態(tài)學觀察，鑒定該菌株為釀酒酵母；通過液體發(fā)酵法確定該菌株產(chǎn)酶的最佳條件為：溫度為32 ℃，酒精濃度為10%。本試驗通過篩選耐酸性和高產(chǎn)性的釀酒微生物，有效解決了釀酒糖化過程前的酸堿調(diào)節(jié)問題，減少釀酒過程中不必要的環(huán)節(jié)，節(jié)約了時間，能夠有效提高工業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)酒率，降低釀酒生產(chǎn)成本。