李倩倩 陳貴元

摘要 [目的]篩選出梨果粗多糖水提醇沉過程中最佳的蛋白質(zhì)和色素的脫除方法。[方法]以蛋白質(zhì)脫除率、多糖保留率以及數(shù)據(jù)加權(quán)平均法構(gòu)成的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選用三氯乙酸法、三氯乙酸-Sevage法、三氯乙酸-正丁醇法、Sevage法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶-Sevage法、木瓜蛋白酶-三氯乙酸法、木瓜蛋白酶-三氯乙酸-正丁醇法和鹽酸法9種脫蛋白方法對(duì)刺梨果粗多糖水提物的脫蛋白效果進(jìn)行對(duì)比;同時(shí)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化三氯乙酸-正丁醇法對(duì)刺梨果粗多糖水提物的脫蛋白工藝條件。并以脫色率和多糖保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較過氧化氫溶液與活性炭粉末對(duì)刺梨果多糖水提物的脫色效果。[結(jié)果]三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白效果最佳，三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白的最佳工藝條件為樣液與試劑體積比為1∶2、三氯乙酸與正丁醇體積比為1∶10、振蕩時(shí)間為60 min，此時(shí)脫蛋白率為78.64%，多糖保留率為86.59%?；钚蕴糠勰?duì)刺梨果粗多糖的脫色素和多糖保留率均優(yōu)于過氧化氫溶液。[結(jié)論]該試驗(yàn)優(yōu)選出的方法具有實(shí)際可操作性，可有效脫除刺梨果粗多糖中的蛋白質(zhì)和色素，最終確定三氯乙酸-正丁醇法和活性炭粉末作為刺梨果多糖初步純化方法，為進(jìn)一步研究多糖的色譜分析、結(jié)構(gòu)鑒定、構(gòu)效關(guān)系和生物活性研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞 刺梨;多糖;提取;脫蛋白;脫色方法;脫色素;活性炭

中圖分類號(hào) TQ281? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）11-0162-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.11.042

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the Method of Deproteinization and Decolorization in the Process of Extracting Polysaccharides from ?Rosa roxburghii ?Fruit

LI Qian-qian1，CHEN Gui-yuan1，2

（1. School of Basic Medical Sciences， Dali University， Dali， Yunnan 671000; 2. Key Laboratory of Insect Biomedicine Research and Development of Yunnan Province， Dali，Yunnan 671000）

Abstract [Objective]To screen out the best method for removing protein pigment in the process of water extraction alcohol precipitation of ?Rosa roxburghii ?fruit crude polysaccharide.[Method]Taking protein removal rate， polysaccharide retention rate and data weighted average method as the evaluation index， 9 kinds of deproteinization methods（trichloroacetic acid method， trichloroacetic acid-Sevage method， trichloroacetic acid-n-butanol method， Sevage method， papain method， papain-Sevage method， papain-trichloroacetic acid method， papain-trichloroacetic acid-n-butanol method hydrochloric acid method） were selected to compare the deproteinization effects of crude polysaccharide water extracts from ?Rosa roxburghii ?fruit.At the same time， on the basis of single factor experiment， orthogonal experiment was used to optimize the deproteinization process conditions of the water extract of ?Rosa roxburghii ?fruit crude polysaccharide by trichloroacetic acid-n-butanol method. And the decolorization rate and polysaccharide retention rate were used as evaluation indicators to compare the decolorization effect of hydrogen peroxide solution and activated carbon powder on the water extract of prickly pear fruit polysaccharide.[Result]The deproteinization effect of the trichloroacetic acid-n-butanol method was the best，the best process conditions for the deproteinization of the trichloroacetic acid-n-butanol method were that the volume ratio of sample solution to reagent was 1∶2， the volume ratio of trichloroacetic acid to n-butanol was 1∶10， and the shaking time was 60 min.At this time， the deproteinization rate was 78.64%， the polysaccharide retention rate was 86.59%.The powdered activated carbon had better depigmentation polysaccharide retention rate of the crude polysaccharides from ?Rosa roxburghii ?fruit than the hydrogen peroxide solution. [Conclusion]The method selected in this test has practical operability， and can effectively remove the protein and pigment in the crude polysaccharide of ?Rosa roxburghii ?fruit. Finally， the trichloroacetic acid-n-butanol method and activated carbon powder are determined as the preliminary purification method of ?Rosa roxburghii ?fruit polysaccharide，which provides data support for further research on chromatographic analysis， structure identification， structure-activity relationship and biological activity research and development of polysaccharides.

Key words ?Rosa roxburghii; Polysaccharide;Extraction;Deproteinization;Decolorization method;Depigmentation;Activated carbon

刺梨 （Rosa roxburghii ?Tratt.，RRT），又名送春歸，為薔薇科薔薇屬多年生落葉小灌木，廣泛分布于云貴高原及攀西高原，是我國(guó)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的野生資源之一。刺梨作為具有地域特色的藥食同源植物，最早文學(xué)記載于公元1640年的《黔書》，隨后《貴州通志》《黔滇記游》《本草便方二亨集》等也對(duì)刺梨的產(chǎn)地、種植栽培技術(shù)及植物形態(tài)等進(jìn)行了詳細(xì)描述[1]。刺梨的藥用價(jià)值最早見于古代醫(yī)學(xué)典籍《本草綱目拾遺》，書中詳細(xì)記錄了刺梨的根、 莖、 花、 葉、果實(shí)不同的治療功效，其獨(dú)特的藥理作用引起眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，刺梨含有豐富的多糖[3]、黃酮[4]、單寧[5]、有機(jī)酸[6]、抗壞血酸[7]、三萜類[8]、SOD[9]、β-谷甾醇[10]、 氨基酸[11]及微量元素[12]等生物活性物質(zhì)。刺梨可溶性多糖含量為8.62%～10.52%（以鮮果重計(jì)）[13]，刺梨多糖 （Rosa roxburghii ?Tratt. polysaccharide，RRTP）不僅作為生物體的結(jié)構(gòu)成分和體內(nèi)主要的供能和儲(chǔ)能物質(zhì)，而且廣泛參加機(jī)體的各項(xiàng)生命活動(dòng)，具有免疫調(diào)節(jié)[14]、抗氧化[15]、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)[16]、降血糖[17]和降血脂[18]等功效，至此多糖已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和醫(yī)藥保健領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)，但是刺梨果多糖水提物中含有色素、蛋白質(zhì)、單糖、寡糖、無機(jī)鹽及有機(jī)雜質(zhì)，不僅影響多糖的初步分離鑒定、后續(xù)純化、結(jié)構(gòu)表征，而且對(duì)具體功效的研發(fā)帶來很大障礙。因此在保證多糖結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的前提下，尋求一種脫色水平高、除蛋白效果好的脫色和脫蛋白工藝技術(shù)對(duì)食品研究與開發(fā)至關(guān)重要。

目前，植物多糖傳統(tǒng)的脫蛋白方法有Sevage法[19]、三氯乙酸法[20]、酶法[21]等，新型的脫蛋白方法如FTT法[22]、DAC法[23]、MCM法[24]、CaCl2法[25]和樹脂吸附法[26]等，也有將2種或者2種以上方法聯(lián)用來進(jìn)行脫蛋白，稱為聯(lián)用法[27]。脫色方法主要有活性炭法[28]、過氧化氫溶液法[29]、柱層析法[30]和反膠束法[31]等。其中活性炭（activated carbon，AC）內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)，具有比表面積大、吸附強(qiáng)、過濾快、脫色純度高的優(yōu)勢(shì)，并且價(jià)格合理、無毒無味，從而廣泛應(yīng)用于環(huán)保、食品、冶金、化工等各領(lǐng)域。當(dāng)活性炭法脫色作用不明顯時(shí)， 需考慮用過氧化氫法脫色。過氧化氫（H2O2）是一種強(qiáng)氧化劑，過氧化氫的漂白作用需要在介質(zhì)水中電解成H+和HO2-，產(chǎn)生氧氣和氫氧化鈉，過氧化鈉同樣具有氧化性。多糖液中， 色素被游離的HO2-氧化而達(dá)到脫色素的目的?；诖?，該研究以刺梨果多糖水提物為原料，采用三氯乙酸法、三氯乙酸-Sevage法、三氯乙酸-正丁醇法、Sevage法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶 + Sevage法、木瓜蛋白酶 + 三氯乙酸法、木瓜蛋白酶-三氯乙酸-正丁醇法、鹽酸法對(duì)其進(jìn)行脫蛋白比較，選擇粉末狀的活性炭和30%過氧化氫溶液對(duì)多糖溶液進(jìn)行脫色，尋求最佳的脫蛋白和脫色工藝參數(shù)，為進(jìn)一步分離純化刺梨果多糖提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試材與試劑 刺梨果，購(gòu)自貴州省遵義市產(chǎn)品，購(gòu)于2020年11月。牛血清白蛋白，上海如吉生物科技有限公司;木瓜蛋白酶（活性≥60萬單位/g，批號(hào)325A027），北京索萊寶科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250，碧云天生物技術(shù)有限公司;活性炭，上海琪特分析儀器有限公司;D-無水葡萄糖（含量≥99%，批號(hào)110833-201506），中國(guó)食品藥品檢定研究院;三氯乙酸、鹽酸、正丁醇、30%過氧化氫溶液、氯仿、磷酸氫二鈉、檸檬酸、氯化鈉、無水乙醇、98%濃硫酸溶液、蒽酮、葡萄糖，天津福晨化學(xué)試劑廠，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 SHA-C恒溫水浴鍋，金壇區(qū)杰瑞爾電器有限公司;BT-224S型電子分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司;RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;754紫外可見光分光光度計(jì)，上海菁華科學(xué)儀器有限公司;TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;SJ-3恒溫磁力攪拌器，常州智博儀器制造有限公司;RXH-5-C遠(yuǎn)紅外節(jié)能鼓風(fēng)循環(huán)式不銹鋼烘箱，上海市崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠;FD-1型冷凍干燥箱，北京博醫(yī)康技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 刺梨果粗多糖的制備[32]。刺梨干果→烘干→粉碎→脫脂→熱水浸提→離心→真空濃縮→醇沉→冷凍干燥→刺梨果粗多糖（RTFP）。

1.3.2 刺梨果多糖保留率的測(cè)定。采用蒽酮-濃硫酸法[33]測(cè)定刺梨果多糖的含量。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，于620 nm處測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為 Y=1.657 9X+0.014 1（R2=0.999 4）， 表明葡萄糖溶液質(zhì)量濃度在0～0.6 mg/mL與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

多糖保留率的計(jì)算公式如下：

C=c2c1 ×100%（1）

式中， C為多糖保留率（%）;c1 為脫蛋白（脫色素）前刺梨果多糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）; c2 為脫蛋白（脫色素）后刺梨果多糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.3.3 刺梨果多糖脫蛋白率的測(cè)定。采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[34]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，于595 nm處測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程 為y=0.055 5x+0.010 1（R2 =0.997 4），表明葡萄糖溶液質(zhì)量濃度在0～6 μg/mL與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

刺梨果多糖脫蛋白效果的評(píng)價(jià)用脫蛋白率表示，計(jì)算公式如下：

M=m1-m2m1×100% （2）

式中， M 為刺梨果多糖脫蛋白率（%）; m1 為刺梨果多糖脫蛋白前樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度（μg/mL）; m2 為刺梨果多糖脫蛋白后樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度（μg/mL）。

1.3.4 刺梨果多糖脫色率的測(cè)定。采用三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白后的刺梨果粗多糖提取液于200～800 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外可見光譜掃描，無法直接測(cè)定其吸光度?？赡苁怯捎诖汤婀嗵翘崛∫好撋昂笙♂尵鶠槌赛S色或者深褐色，根據(jù)互補(bǔ)色原理，刺梨果多糖提取液主要吸收藍(lán)色波段（446～464 nm）可見光[35]，故選擇中心波段作為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定刺梨果多糖溶液在450 nm處的吸光度。

刺梨果多糖脫色效果的評(píng)價(jià)用脫色率表示，計(jì)算公式如下：

A=a1-a2a1×100%（3）

式中， A 為脫色率（%）; a1 為刺梨果多糖溶液通過活性炭脫色前的吸光度; a2 為刺梨果多糖溶液通過活性炭脫色后的吸光度。

1.3.5 綜合評(píng)分。數(shù)據(jù)處理采用綜合評(píng)分加權(quán)評(píng)分法，分別測(cè)定脫蛋白率、脫色率和多糖保留率，將各項(xiàng)指標(biāo)除以該列最大值，兩者的權(quán)重均設(shè)為50。按照以下公式計(jì)算綜合評(píng)分：

B=AA max×50+ CC max×50（4）

D=MM max×50+ CC max×50（5）

式中， B 為脫色率的綜合評(píng)分（分）; A 為脫色率（%）; A max為脫色率的最大值（%）; D為脫蛋白率的綜合評(píng)分（分）;M為脫蛋白率（%）;M max為脫蛋白率的最大值（%）; C為多糖保留率（%）;C max為多糖保留率的最大值（%）。

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1.3.6 刺梨果多糖脫蛋白方法。

1.3.6.1 不同脫蛋白方法的比較。配制成1 mg/mL的刺梨果粗多糖樣液，取50 mL于200 mL的錐形瓶中，分別采用9種不同的方法進(jìn)行脫蛋白比較。

（1）三氯乙酸法。加入50 mL的20%三氯乙酸溶液，1 800 r/min攪拌20 min，靜置過夜，6 000 r/min離心15 min，收集上清液測(cè)定刺梨果多糖提取液中蛋白質(zhì)和多糖質(zhì)量濃度，計(jì)算刺梨果多糖提取液的脫蛋白率和多糖保留率。

（2）三氯乙酸-Sevage法。加入50 mL的10%三氯乙酸溶液和10 mL的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇體積比=4∶1），2 000 r/min攪拌20 min，6 000 r/min離心15 min，收集上清液測(cè)定刺梨果多糖提取液中蛋白質(zhì)和多糖質(zhì)量濃度，計(jì)算刺梨果多糖提取液的脫蛋白率和多糖保留率。

（3）三氯乙酸-正丁醇法。加入100 mL三氯乙酸-正丁醇（1∶10， V/V ）混合液于錐形瓶中，1 800 r/min攪拌20 min，6 000 r/min離心15 min，收集上清液測(cè)定刺梨果多糖提取液中蛋白質(zhì)和多糖質(zhì)量濃度，計(jì)算刺梨果多糖提取液的脫蛋白率和多糖保留率。

（4）Sevage法。加入12.5 mL的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇體積比=4∶1），1 600 r/min攪拌20 min，6 000 r/min離心15 min，棄去下層有機(jī)相和中間層狀膠狀變形蛋白質(zhì)層，取上清液分別測(cè)定蛋白和多糖含量，計(jì)算脫蛋白率和多糖保留率。

（5）木瓜蛋白酶法。稱取1%的木瓜蛋白酶加入50 mL的粗多糖溶液中，在20倍體積的pH為6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的前提下，酶解溫度60 ℃水浴振蕩水解1 h，100 ℃滅酶10 min后室溫冷卻，6 000 r/min離心15 min，取上清液分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量和多糖含量，計(jì)算脫蛋白率和多糖保留率。

（6）木瓜蛋白酶 + Sevage法。量取50 mL的刺梨果多糖水提物置于錐形瓶中，首先按照木瓜蛋白酶法脫蛋白的條件對(duì)粗多糖提取液進(jìn)行脫蛋白處理一次，再用Sevage法對(duì)酶解后的粗多糖提取液再次脫蛋白處理，最終獲得木瓜蛋白酶-Sevage法脫蛋白處理的上清液，分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量和多糖含量，計(jì)算脫蛋白率和多糖保留率。

（7）木瓜蛋白酶 + 三氯乙酸法。量取50 mL的刺梨果多糖水提物置于錐形瓶中，首先按照木瓜蛋白酶法脫蛋白的條件對(duì)粗多糖提取液進(jìn)行脫蛋白處理一次，再用三氯乙酸法對(duì)酶解后的粗多糖提取液再次脫蛋白處理，最終獲得木瓜蛋白酶-三氯乙酸法脫蛋白處理的上清液，收集上清液測(cè)定刺梨果多糖提取液中蛋白質(zhì)和多糖質(zhì)量濃度，計(jì)算刺梨果多糖提取液的脫蛋白率和多糖保留率。

（8）木瓜蛋白酶-三氯乙酸-正丁醇法。依次用木瓜蛋白酶法、三氯乙酸法、正丁醇法脫蛋白，收集上清液測(cè)定刺梨果多糖提取液中蛋白質(zhì)和多糖質(zhì)量濃度，計(jì)算刺梨果多糖提取液的脫蛋白率和多糖保留率。

（9）鹽酸法。加入50 mL的1 mol/L鹽酸溶液，1 800 r/min振蕩20 min，6 000 r/min離心15 min，收集上清液測(cè)定刺梨果多糖提取液中蛋白質(zhì)和多糖質(zhì)量濃度，計(jì)算刺梨果多糖提取液的脫蛋白率和多糖保留率。

1.3.6.2 三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白工藝優(yōu)化。選取對(duì)三氯乙酸-正丁醇法對(duì)刺梨果多糖提取液脫蛋白效果影響較大的3個(gè)因素：樣液與試劑體積比（A）、三氯乙酸與正丁醇體積比（B）和振蕩時(shí)間（C），按L9（34）正交表（表1）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.7 刺梨果多糖的脫色方法。

1.3.7.1 過氧化氫脫色。量取1 mg/mL刺梨果多糖提取液50 mL，分別加入0.5%、1.0%、1.5%的過氧化氫溶液，置于40 ℃恒溫水浴鍋中振蕩脫色30 min，之后1 800 r/min攪拌20 min，6 000 r/min離心15 min，收集刺梨果多糖脫色后的上清液，測(cè)定吸光度和多糖含量，計(jì)算不同含量的過氧化氫溶液的脫色后的脫色率和多糖保留率。

1.3.7.2 活性炭粉末脫色。活性炭預(yù)處理：活性炭經(jīng)去離子水多次洗滌后，110 ℃烘干24 h，研磨制備成活性炭粉末，儲(chǔ)藏備用。

取50 mL的粗多糖溶液（1 mg/mL），加入干燥至恒重的活性炭粉末，使活性炭粉末在多糖溶液中的終濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%，置于40 ℃恒溫水浴鍋中振蕩脫色30 min，之后1 800 r/min攪拌20 min，6 000 r/min離心15 min，收集刺梨果多糖脫色后的上清液，測(cè)定吸光度和多糖含量，計(jì)算不同含量的活性炭粉末的脫色率和多糖保留率。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺梨果粗多糖脫蛋白

2.1.1 不同脫蛋白方法的比較。從脫蛋白效果（圖1）角度分析，脫蛋白率從大到小依次為木瓜蛋白酶-三氯乙酸-正丁醇法>三氯乙酸-正丁醇法>木瓜蛋白酶-三氯乙酸法>木瓜蛋白酶-Sevage法>三氯乙酸-Sevage法>木瓜蛋白酶法>三氯乙酸法>鹽酸法>Sevage法，表明酶法和化學(xué)法聯(lián)用脫除刺梨果多糖中蛋白質(zhì)的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)采用酶法或者化學(xué)法脫蛋白效果;木瓜蛋白酶-三氯乙酸-正丁醇法和三氯乙酸-正丁醇法對(duì)粗多糖中蛋白質(zhì)的脫除效果較好，脫蛋白率均高于70%，并且前者高于后者。

從多糖保留率（圖1）方面分析，多糖保留率從大到小依次為三氯乙酸法-正丁醇法>三氯乙酸-Sevage法>木瓜蛋白酶法>木瓜蛋白酶-Sevage法>木瓜蛋白酶-三氯乙酸-正丁醇法>木瓜蛋白酶-三氯乙酸法>Sevage法>三氯乙酸法>鹽酸法;三氯乙酸-正丁醇法明顯高于木瓜蛋白酶-三氯乙酸-正丁醇法，這可能是由于酶法與化學(xué)法聯(lián)用，即使可以使一部分游離蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白質(zhì)發(fā)生水解反應(yīng)，但是復(fù)雜的工藝流程造成多糖過度損失，多糖保留率有所降低。

鑒于此，將脫蛋白率和多糖保留率進(jìn)行數(shù)據(jù)加權(quán)法綜合評(píng)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綜合評(píng)分從高到低依次為三氯乙酸-正丁醇法>木瓜蛋白酶-三氯乙酸-正丁醇法>三氯乙酸-Sevage法>木瓜蛋白酶-Sevage法>木瓜蛋白酶-三氯乙酸法>木瓜蛋白酶法>三氯乙酸法>Sevage法>鹽酸法。綜上所述，為簡(jiǎn)化工藝流程，確定三氯乙酸-正丁醇法用于刺梨果多糖提取液的脫蛋白工藝。

2.1.2 三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白工藝條件優(yōu)化。由表2可知，影響三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白效果的因素從大到小依次為樣液與試劑體積比（A）>三氯乙酸與正丁醇體積比（B）>振蕩時(shí)間（C），即樣液與試劑的體積比對(duì)脫蛋白效果影響最大，其次為三氯乙酸與正丁醇的體積比，振蕩時(shí)間對(duì)脫蛋白效果影響最小。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣液與試劑的體積比、三氯乙酸與正丁醇的體積比對(duì)刺梨果提取液蛋白質(zhì)脫除率有極顯著影響（ P<0.001），振蕩時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)脫除率有顯著影響（P <0.01）。

三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白的最佳工藝條件為 A1B2C3，即樣液與試劑的體積比為1∶2，三氯乙酸和正丁醇的體積比為1∶10，振蕩時(shí)間60 min。在最佳工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得出脫蛋白率為78.64%，多糖保留率為86.59%，綜合評(píng)分為98.04分，表明該試驗(yàn)所確定的最優(yōu)脫色工藝的參數(shù)的真實(shí)性和準(zhǔn)確性，具有實(shí)際意義。

2.1.3 脫蛋白前后紫外光譜分析。從刺梨果粗多糖脫蛋白前后紫外吸收光譜（圖2）可以看出，未進(jìn)行脫蛋白時(shí)，刺梨果粗多糖水提物中存在蛋白質(zhì)和核酸，蛋白質(zhì)溶液在275～280 nm具有一個(gè)紫外吸收高峰;核苷、核苷酸和核酸在240～290 nm的紫外波段有一個(gè)強(qiáng)烈的吸收峰;因此在250～300 nm匯合一個(gè)共同的吸收峰，說明存在蛋白質(zhì)和核酸的存在。脫蛋白后的刺梨果粗多糖在240～290 nm出現(xiàn)吸收峰降低，表明只有極少的蛋白質(zhì)和核酸的存在，進(jìn)一步說明了通過三氯乙酸-正丁醇法對(duì)刺梨果粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理，可以達(dá)到良好的脫蛋白效果。

2.2 刺梨果粗多糖脫色方法比較 從圖3可以看出，其中活性炭粉末對(duì)刺梨果多糖水提物具有良好的脫色效果，其脫色率和多糖保留率均略高于過氧化氫溶液，這可能是由于活性炭粉末的吸附能力強(qiáng)，吸附色素的同時(shí)也吸附一定量的多糖，并且活性炭粉末和粗多糖溶液容易形成黏稠狀物質(zhì)，不易分離，造成多糖含量損失;過氧化氫是將有色的物質(zhì)氧化為無色，并非去除色素，并且過氧化氫屬于強(qiáng)氧化劑，氧化色素的同時(shí)也將多糖氧化分解，造成多糖含量降低和結(jié)構(gòu)破壞。鑒于此，脫色劑的不同和脫色劑用量的差異均對(duì)刺梨果多糖水提物脫色效果有顯著差異，由脫色率、多糖保留率、綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)可知，1.5%的活性炭粉末脫色率為70.87%，多糖保留率為84.06%，綜合評(píng)分達(dá)到96.11分。鑒于此，最終選擇終濃度為1.5%的活性炭粉末對(duì)刺梨果多糖水提物進(jìn)行脫色。

3 結(jié)論

采用水提醇沉法所得到的植物多糖溶液中常含有一定量的蛋白質(zhì)和植物色素，不僅影響美觀而且影響其純度。為得到純度較高的刺梨果精制品，該研究以脫蛋白率、脫色率、多糖保留率以及綜合加權(quán)平均法計(jì)算出的綜合評(píng)分為指標(biāo)，采用三氯乙酸法、三氯乙酸-Sevage法、三氯乙酸-正丁醇法、Sevage法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶-Sevage法、木瓜蛋白酶-三氯乙酸法、木瓜蛋白酶-三氯乙酸-正丁醇法和鹽酸法9種不同方法對(duì)刺梨果多糖提取液進(jìn)行脫蛋白，結(jié)果表明，三氯乙酸-正丁醇法的脫蛋白效果較好。為探索三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白的最佳工藝條件，選取樣液與試劑體積比、三氯乙酸與正丁醇體積比、振蕩時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)因素對(duì)脫蛋白效果的影響主次順序?yàn)闃右号c試劑體積比>三氯乙酸-正丁醇體積比>振蕩時(shí)間，優(yōu)化后最佳的工藝條件為樣液與試劑的體積比為1∶2，三氯乙酸與正丁醇的體積比為1∶10，振蕩時(shí)間60 min。在最佳工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得出脫蛋白質(zhì)為78.64%，多糖保留率為86.59%，此時(shí)綜合評(píng)分為98.04分，表明正交試驗(yàn)所確定的脫色工藝條件的可靠性。

采用不同質(zhì)量濃度的過氧化氫溶液和活性炭粉末對(duì)刺梨果多糖進(jìn)行脫色處理，過氧化氫對(duì)刺梨果粗多糖脫色效果較差，造成多糖保留率較高，故在脫色劑選擇上，應(yīng)考慮脫色效果和多糖保留率兩者的綜合效應(yīng)，最終選擇1.5%的活性炭粉末對(duì)刺梨果多糖水提物進(jìn)行脫色。該試驗(yàn)改善了刺梨果多糖提取液的顏色，提高了刺梨果多糖提取液的純度，對(duì)后續(xù)刺梨果多糖的進(jìn)一步研究具有參考價(jià)值。

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