李振芳，彭 嬋，黃國偉，馬林江，柯尊發(fā)，楊彥伶

（1.湖北省林業(yè)科學研究院，武漢 430075；2.湖北省太子山林場管理局，湖北 京山 431822）

紫薇（Lagerstroemia indica）培育新品種主要是通過雜交育種［1］，種間雜交作為一種獲取優(yōu)良性狀、提高抗性和拓寬遺傳多樣性的重要手段，國內外早已開展此項工作，將屋久島紫薇（L.fauriei）、福建紫薇（L.limii）和南紫薇（L.subcostata）等種質資源引入紫薇雜交群體，且表現(xiàn)出良好的種間親和性［2-4］，而紫薇與尾葉紫薇（L. caudata）的種間親和性則較低［5］，表明紫薇不同種間雜交子代育性差異較大。大花紫薇（L.speciosa）作為紫薇屬1 個花大、葉大、植株高大的特殊種質［1］，Pounders 等［6］利用紫薇品種Tonto 與大花紫薇進行雜交獲得的子代植株高度不育，胡杏等［7］發(fā)現(xiàn)紫薇與大花紫薇雜交子代中除1株植株外其余均高度不育，焦垚［8］發(fā)現(xiàn)大花紫薇與紫薇品種Sacramento、Dynamite 正反交的子代均高度不育，Purple Velet×大花紫薇的雜種子代中除3 個植株可結實外其余均高度不育，而這4 株可育子代性狀均偏向紫薇品種性狀［7，8］，紫薇與大花紫薇雜種子代高度不育，阻礙了抗寒性等優(yōu)良基因的繼續(xù)滲入。

細胞遺傳分化可能會干擾紫薇某些雜交組合育性的差異［1］，紫薇染色體數(shù)目最近的報道均為2n=48［9-16］，大花紫薇染色體數(shù)目最近的報道以2n=48 居多［1，6，17-19］，但也有2n=50［20-23］；采用流式細胞儀測定紫薇為二倍體［9，10，24-26］，劉亞瓊［27］測定大花紫薇為六倍體，而劉婷婷等［28］測定其為二倍體，因此，有必要確定紫薇與大花紫薇雜種子代的倍性。

目前倍性鑒定方法中，染色體計數(shù)準確性高但操作繁瑣、技術要求也高，紫薇作為染色體小且數(shù)量眾多的物種，難以取得滿意的結果［24，25］；流式細胞儀測定廣泛適用于物種倍性鑒定，快速、準確，適合大量樣本篩查，但采用外標法不能準確判定非整倍體［29，30］；利用SSR 分子標記可快速準確分析大量樣本，但成本相對較高［31，32］。本研究利用湖北省林業(yè)科學研究院紫薇育種課題組前期獲得的一批紫薇與大花紫薇的種間雜種子代，采用流式細胞儀和SSR標記對其倍性進行評估，以期為推進紫薇與大花紫薇種間雜交育種工作提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

2013—2015 年以大花紫薇為父本，紫薇品種Dynamite、鄂薇3 號（L.indica‘Ewei 3’）、D3-5、D3-7 4 個紫薇品種或無性系為母本進行雜交，獲得4 個雜交組合的F1代實生苗植株。試驗材料包括F1代實生苗植株、大花紫薇、紫薇品種Dynamite、尾葉紫薇、福建紫薇、屋久島紫薇。各材料為扦插繁殖植株，分別保存于武漢九峰森林培育試驗示范國家長期科研基地和湖北省太子山林管局仙女林場。

1.2 流式細胞儀檢測

1.2.1 樣品準備及上機分析 采用德國Partec 公司生產(chǎn)的流式細胞儀CyFlow Cube 進行紫薇樣品倍性分析。選取扦插后剛萌發(fā)的新鮮嫩葉（約0.5 cm2），置于塑料培養(yǎng)皿內，加入400～500 μL 檢測試劑盒的細胞核提取緩沖液，用刀片將其快速切碎，放置10～30 s 后加入1.5～1.6 mL 檢測試劑盒的DNA 染色液緩沖液，最后用30 μm 的微孔濾膜將樣品過濾到2.5 mL 的試管中，上樣檢測［33，34］。

檢測試劑盒A 為抗氧化提取試劑盒CyStain UV OxProtect（Staining Buffer）；檢測試劑盒B 為Cystain UV Precise P（Nuclei Extraction Buffer、Staining Buffer），均購于Partec 公司。

1.2.2 倍性分析 流式細胞分析圖中，橫坐標為熒光強度，縱坐標為細胞數(shù)量，熒光強度反映了細胞內DNA 含量的多少［35］。測定樣本倍性的公式如下［36］。

評判分析效果一般用變異系數(shù)（CV）值，富含酚類等物質的樣本，當CV＜5%時，所測數(shù)據(jù)是理想的；當CV＜10%時，所測數(shù)據(jù)是比較理想的［37］。

1.3 分子標記鑒定

3—4 月取待測紫薇植株的幼嫩葉片2～4 片，二氧化硅干燥后，保存于-80 ℃冰箱。葉片總DNA 提取采用生工生物工程（上海）股份有限公司試劑盒B518261。DNA 純 度 和 濃度 采 用NanoDrop 2000 紫外分光光度計檢測，稀釋至20 ng/μL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。從彭嬋等?8］篩選出的15 條擴增條帶單一、目的帶型清晰的標記中，選擇PIC指數(shù)大于0.5 的8 條SSR 引物進行鑒定［32］（表1），引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR 擴增反應體系具體參照彭嬋等［38］的方法進行，擴增產(chǎn)物用美國ABI 3730XL 測序儀檢測。判讀每個SSR 標記在每個樣品中擴增位點的等位基因數(shù)，若等位基因數(shù)為1～2，則待測樣品為二倍體，等位基因數(shù)為1～4，則待測樣品為四倍體，等位基因數(shù)為1～6，則待測樣品為六倍體［32，39-42］。

表1 SSR 引物信息

2 結果與分析

2.1 不同提取試劑盒對流式細胞儀檢測紫薇出鋒效果的影響

紫薇葉片含有大量的蛋白質、糖和酚類化合物，不利于細胞核的提取，倍性檢測時容易出現(xiàn)峰形較差、較小的情況［24，43］。以大花紫薇、屋久島紫薇為材料，比較Cystain UV Precise P 和CyStain UV OxProtect 2 種不同提取試劑盒對流式細胞儀出鋒效果的影響，結果見圖1。由圖1 可以看出，抗氧化試劑盒（CyStain UV OxProtect 試劑盒）的結果圖中背景碎片少，主峰明顯集中，且屋久島紫薇的結果中可以看到明顯的G2 峰，G1 峰細胞核數(shù)量明顯增多；另外，大花紫薇的提取效果較差，抗氧化試劑盒的結果中背景碎片也很多。

圖1 流式細胞儀不同提取試劑盒提取紫薇的出峰結果比較

2.2 紫薇屬植物流式細胞儀倍性分析

以已知染色體倍性的尾葉紫薇［44］（二倍體，2n=48）為對照，采用檢測試劑盒A 對屋久島紫薇、福建紫薇、大花紫薇進行倍性檢測，結果（圖2、表2）表明，屋久島紫薇、福建紫薇、大花紫薇3 個品種的倍性與尾葉紫薇相同，均為二倍體，變異系數(shù)為8.08%～9.45%，流式細胞儀分析結果見圖2。

圖2 紫薇屬紫薇流式細胞儀分析結果

表2 紫薇屬植物流式細胞儀倍性

2.3 紫薇×大花紫薇雜交F1代植株流式細胞儀倍性鑒定

以尾葉紫薇為對照，采用檢測試劑盒B 對紫薇×大花紫薇雜交F1代植株、Dynamite、大花紫薇、福建紫薇進行倍性檢測，結果（表3）表明，整體變異系數(shù)為5.80%～7.88%，紫薇×大花紫薇雜交F1代植株的倍性與尾葉紫薇相同，均為二倍體，同時檢測親本Dynamite、大花紫薇的倍性也為二倍體，福建紫薇的倍性也為二倍體，流式細胞儀分析結果見圖3。

圖3 紫薇樣品植株流式細胞儀倍性檢測結果

表3 紫薇×大花紫薇雜交F1代植株流式細胞儀倍性檢測結果

由圖3 可知，有些紫薇樣品的結果有2 個峰，分別是突出的G1 峰和較小或有時無法檢測到的G2峰，分別代表了不同細胞周期的細胞核，采用新鮮葉片樣品進行檢測通常會得到這樣的結果［30，45］。

2.4 利用SSR 分子標記進行倍性分析

利用SSR 分子標記進行倍性分析，獲得引物擴增譜帶后，如圖4 所示，以引物P10 為例，統(tǒng)計8 對SSR 引物在紫薇品種Dynamite、大花紫薇、福建紫薇、26 株紫薇×大花紫薇種間雜種F1代植株的等位基因數(shù)（表4）。由表4 可見，29 份紫薇樣品在每個引物位點的等位基因數(shù)均為1～2 個，說明所有檢測樣品的倍性均為二倍體。

表4 8 對引物的等位基因大小和倍性估計

圖4 引物P10 的擴增圖譜

3 小結與討論

合適的細胞核提取液對于獲得理想的核懸浮液至關重要，也是流式細胞儀獲得較好結果的關鍵，但目前還未發(fā)現(xiàn)一種適用于植物的通用解離液［45］。木本植物因為葉片中含有多酚、單寧、花色素苷和黏性物質而使其提取效果相對較差［46］，本研究采用Cystain UV Precise P 和CyStain UV OxProtect 2 種不同提取試劑盒在紫薇葉片的提取上都有較好的效果，抗氧化試劑盒CyStain UV OxProtect 在尾葉紫薇、屋久島紫薇上都有相對不錯的改善效果，表現(xiàn)出碎片減少、細胞核數(shù)更高，峰圖質量提高，但在大花紫薇、福建紫薇以及紫薇×大花紫薇子代植株上未見到明顯效果，對比試驗時甚至未檢測到明顯的峰。推測可能與葉片狀態(tài)有關，建議選取更為幼嫩的葉片材料來進行檢測。紫薇葉片含有多糖、多酚類物質，聶碩［43］在提取緩沖液中加入1%PVP 也不能完全消除雜質對細胞核提取效果的影響，可考慮添加PVP-40 或PVP-360 減少多酚和其他次生代謝物的影響［36］。

流式細胞儀常規(guī)的倍性分析多采用外標法［47］，Pellicer 等［36］建議已知倍性的對照樣本應為該物種已知的最低倍性水平，楊冰潔等［11］用染色體計數(shù)法統(tǒng)計紫薇、屋久島紫薇和福建紫薇的染色體數(shù)目均為2n=48，楊冰潔［44］用染色體計數(shù)法和FISH 技術確定紫薇、屋久島紫薇、福建紫薇和尾葉紫薇的染色體數(shù)目為2n=48，劉亞瓊［27］用流式細胞儀檢測紫薇、屋久島紫薇、福建紫薇、尾葉紫薇等11 個品種為二倍體，劉婷婷等［28］采用流式細胞儀測定尾葉紫薇、屋久島紫薇、大花紫薇、南洋紫薇、網(wǎng)脈紫薇、川黔紫薇、桂林紫薇、紫薇、紫薇‘粉精靈’、紫薇‘Pocomoke’等紫薇屬10 個種或品種均為二倍體。本研究以尾葉紫薇作為對照，選取扦插后剛萌發(fā)的新鮮嫩葉，檢測了屋久島紫薇、福建紫薇、大花紫薇等紫薇屬植物的倍性均為二倍體，紫薇品種Dynamite、12 份紫薇×大花紫薇種間雜種子代植株也均為二倍體。流式細胞儀檢測結果中有些樣品表現(xiàn)出明顯的雙峰，其中G2 峰表現(xiàn)為較小的峰，有些樣品甚至沒有檢測到，這與Dole?el 等［30］的結論相符?；毂扼w或嵌合體植株分析結果也表現(xiàn)出明顯的雙峰，但其G2 峰相比新鮮葉片二倍體的G2 峰細胞核數(shù)量更多、峰更高，在結果中表現(xiàn)為G1 峰、G2 峰高度差距不大［24，30］。宋新紅等［48］研究發(fā)現(xiàn)，紫薇二倍體與人工誘導四倍體植株流式細胞儀檢測結果中都有3 個峰且第1 個峰位置相同，認為有核內多倍性發(fā)生，Dole?el 等［30］認為內多倍體的存在可以通過額外的具有更高DNA水平的峰來證明。

賈會霞等［49］研究證實了SSR 標記能較好地反映植物的倍性情況，可以作為檢測植物倍性的重要依據(jù)，目前結合流式細胞儀已在康乃馨［40］、油茶［39］、棗樹［50］、美洲黑楊［32］等樹種的種質資源倍性鑒定上成功應用。本研究采用8 條SSR 標記判定紫薇品種Dynamite、大花紫薇、福建紫薇、26 株紫薇×大花紫薇種間雜種F1代植株的倍性均為二倍體，這與流式細胞儀的結果一致，證實了SSR 標記結合流式細胞儀反映植物倍性的可行性，為紫薇種間雜交育種工作奠定了基礎。