楊浩，王文杰，雷霜江，呂青遙，杜鳳瑤，焦士蓉

西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（成都 610039）

臘梅[Chimonanthus praecox（L.）Link]為臘梅科臘梅屬落葉叢生灌木[1]，多分枝，皮灰白色，生長于亞熱帶濕潤的常綠落葉闊葉混交林地帶，屬于第四紀(jì)冰川孑遺植物。臘梅是我國的特產(chǎn)植物，在我國南部分布廣泛，以長江流域最為豐富。臘梅的花、莖、根均可入藥，具有解毒清熱、理氣開郁的功效，常用于治療感冒、解熱鎮(zhèn)痛、止咳化痰、降壓和改善免疫系統(tǒng)，功效顯著[2]。植物化學(xué)研究表明臘梅花富含龍腦、桉精油和芳樟醇等精油成分[3-4]，黃英等[5]報(bào)道臘梅花精油中含有的β-欖香烯能抑制癌細(xì)胞生長，促進(jìn)凋亡細(xì)胞死亡。此外，臘梅花中還含有非揮發(fā)性的生物堿、黃酮類、多酚類等物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗菌、抗炎癥、抗氧化、抗高血壓及糖尿病等作用[6-10]。

此次試驗(yàn)為了進(jìn)一步從臘梅花中尋找具有生物活性的天然產(chǎn)物，分別對臘梅花揮發(fā)油成分和非揮發(fā)性成分多酚類物質(zhì)進(jìn)行提取和研究。采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對超臨界CO2萃取臘梅花揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，高效液相色譜法（HPLC）分析其臘梅花多酚成分，為進(jìn)一步開發(fā)利用臘梅的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供參考。

1 試驗(yàn)方法

1.1 多酚提取方法

參考包善思等的提取方法[11]，將臘梅花干花粉碎后過80目（粒度：198 μm）篩，于60 ℃恒溫干燥12 h，采用乙醇以料液比1∶30 g/mL微波提取，微波功率406 W，微波時(shí)間50 s，將提取液離心（7000 r/min）10 min，收集上清液，濃縮凍干，將凍干樣品于4 ℃保存。

1.1.1 多酚含量測定[12]

稱取10 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，于100 mL容量瓶中，加去離子水溶解，定容，配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的母液備用。準(zhǔn)確吸取母液0，2，4，6，8和10 mL分別置于10 mL的比色管中，用去離子水定容得0，0.02，0.04，0.06，0.08和0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管中，再加入0.5 mL 0.25 mol/L的福林酚試劑，在室溫下反應(yīng)5 min，最后加入2 mL 10% Na2CO3溶液，定容至刻度線，室溫避光靜置1.5 h，在765 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.1.2 樣品多酚含量測定

取0.5 mL多酚凍干樣品溶液，按照1.1.1方法測其吸光度，依次測定5次，取平均值。由按式（1）計(jì)算樣品中總多酚含量。

式中：c為提取液中多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；v為樣品溶液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為臘梅花粉總量，mg。

1.2 臘梅花揮發(fā)油提取

將剛摘的臘梅花自然風(fēng)干，稱取200 g干燥臘梅花粉碎過30目（粒度：495 μm）篩。將臘梅粉裝入料筒放進(jìn)萃取釜，按工藝要求開啟萃取裝置，調(diào)節(jié)萃取壓力30 MPa、萃取溫度40 ℃、萃取時(shí)間3.0 h、CO2流量25 kg/h，待制冷系統(tǒng)、萃取溫度和CO2流量穩(wěn)定后，開動高壓泵進(jìn)行循環(huán)萃取[13]。萃取3 h后，打開萃取閥，收集精油，在4 ℃下保存。精油得率按式（2）計(jì)算。

1.3 高效液相色譜法（HPLC）分析臘梅多酚提取物

1.3.1 樣品處理

稱取0.225 g凍干樣品，加入22.5 mL甲醇，配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的樣品溶液，搖勻，離心，取上清液，稀釋5倍，用0.22 μm濾膜濾過，得到質(zhì)量濃度為2 mg/mL的樣品進(jìn)樣分析。

1.3.2 標(biāo)品配制

分別稱取10 mg槲皮素、山柰酚、綠原酸、蘆丁、阿魏酸、沒食子酸對照品，用甲醇溶解定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL儲備液，分別取10，20，30，40和50 mL儲備液定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，過0.22 μm濾膜備用，用于該6個(gè)化合物的定性鑒定。

1.3.3 色譜條件

參考夏瑋等[14]的方法。Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，15% B；5～8 min，15%～100% B；8～17 min，100%～100% B；17～20 min，100%～15% B；20～23 min，15%～15% B）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長360 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.4 臘梅花揮發(fā)油GS-MS分析

1.4.1 頂空進(jìn)樣

將揮發(fā)油加入頂空進(jìn)樣瓶中，加入3%氯化鈉，將進(jìn)樣瓶在60 ℃水浴中孵育40 min，期間插入進(jìn)樣針，富集樣品。

1.4.2 氣相色譜條件[13]

色譜柱：Rtx-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫條件：初始溫度60 ℃，保持1.0 min，以3 ℃/min的速率升至200 ℃，保持5 min；柱箱溫度：60 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣模式：分流；壓力：40.6 kPa；總流量：23.8 mL/min；柱流量：0.80 mL/min；線速度：32.6 cm/s；吹掃流量：3.0 mL/min；分流比：25.0；載氣：氦氣；進(jìn)樣量：1 μL；溶劑延遲：2.0 min。

質(zhì)譜條件：電離方式：EI；電子能量：70 eV；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：200 ℃；ACQ方式：

Scan；掃描速度：769 amu/s；掃描范圍：40～400 amu。

2 結(jié)果分析

2.1 高效液相色譜成分分析結(jié)果

通過福林酚反應(yīng)測定臘梅花多酚提取物純度，多酚含量為124.06 mg/g，在360 nm波長下對臘梅花多酚提取物進(jìn)行高效液相色譜分析，其HPLC圖譜如圖1所示。通過對同一標(biāo)品不同濃度的峰面積進(jìn)行計(jì)算得出濃度與峰面積之間的擬合函數(shù)，然后根據(jù)樣品峰面積計(jì)算樣品中對應(yīng)物質(zhì)的含量，成分鑒定見表1。

圖1 臘梅花多酚提取物HPLC色譜圖

表1 樣品中各成分分析表

結(jié)果表明，臘梅花多酚提取物的主要成分為兒茶素、綠原酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素和山奈酚，其中山奈酚含量最高（42.57 mg/g），阿魏酸其次（42.51 mg/g），然后是綠原酸（32.12 mg/g），兒茶素含量為20.75 mg/g，槲皮素含量較低，只有7.32 mg/g，蘆丁含量最低，只有4.98 mg/g。根據(jù)文獻(xiàn)資料[15-18]，山奈酚、阿魏酸、綠原酸和槲皮素具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗血小板凝固、降血脂、防止動脈粥樣硬化和增強(qiáng)免疫力等功效，因此臘梅花的藥理作用可能主要?dú)w因于這幾種物質(zhì)的共同作用。

2.2 臘梅花揮發(fā)油GC-MS分析

200 g新鮮臘梅花原料采用超臨界CO2萃取得到2.63 g精油，精油得率為1.32%，將提取的精油加入1.5 g NaCl在60 ℃下加熱孵育40 min，使其揮發(fā)性成分能更好的富集在頂空進(jìn)樣針上，然后進(jìn)行GC-MS分析，色譜圖如圖2所示。對精油成分進(jìn)行鑒定，見表2。

圖2 臘梅花揮發(fā)油GC-MS圖譜

表2 臘梅花揮發(fā)油成分鑒定表

接表2

通過GC-MS自帶的NISTO5s.LIB和NISTO5.LIB譜圖庫自動檢索獲得目標(biāo)組分的初步鑒定結(jié)果，再結(jié)合相關(guān)專業(yè)知識和有關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行人工譜圖解析，最終確定精油化學(xué)組成成分，總共鑒定出42個(gè)香氣成分，其中：醇類4個(gè)，占11.78%；醛類2個(gè)，占1.13%；酯類1個(gè)，占1.12%；萜烯類30個(gè)，占74.75%；其他成分5個(gè)，占11.22%。含量較高的成分為β-石竹烯（15.57%）、（+）-δ-杜松烯（10.01%）、（-）-α-依蘭油烯（9.16%）、芐醇（8.16%）、α-蒎烯（7.35%）、（+/-）-順式-金剛烷烯（7.01%）、欖香烯（5.7%）、雙環(huán)菊酯（4.89%）、芳樟醇（2.58%）。β-石竹烯和它的?；锞哂刑厥獾南阄叮瑫r(shí)還有抗焦慮、抗抑郁等[19]作用，使其被用于開發(fā)化妝品、香水和除臭劑[20]等產(chǎn)品，β-石竹烯和其衍生物還有很多醫(yī)藥方面的活性，王志祥[21]在專利中報(bào)到β-石竹烯具有鎮(zhèn)咳、祛痰等作用，可用于制作適當(dāng)?shù)膹?fù)方制劑。此研究結(jié)果可為臘梅花揮發(fā)油開拓更廣泛的應(yīng)用市場奠定可靠的理論基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

主要對臘梅花的天然活性產(chǎn)物進(jìn)行了提取研究，包括其揮發(fā)性成分和多酚類物質(zhì)，并通過HPLC及GC-MS分析鑒定其成分，為臘梅花天然活性產(chǎn)物及代謝產(chǎn)物的研究和生物資源的開發(fā)利用提供了可靠的理論依據(jù)和技術(shù)方法。采用微波輔助法提取臘梅花多酚物質(zhì)，多酚含量為124.06 mg/g，通過HPLC分析臘梅花多酚物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要成分為綠原酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素和山奈酚，其中山奈酚含量最高（42.57 mg/g），阿魏酸其次（42.51 mg/g），然后是綠原酸（32.12 mg/g），兒茶素含量為20.75 mg/g，槲皮素含量較低，只有7.32 mg/g，蘆丁含量最低，只有4.98 mg/g。采用超臨界CO2萃取臘梅花揮發(fā)油，精油得率為1.32%，并用GC-MS分析其成分總共鑒定出42個(gè)香氣成分，其中萜烯類30個(gè)，含量最高，占74.75%。相對含量較高的成分為β-石竹烯（15.57%）、（+）-δ-杜松烯（10.01%）、（-）-α-依蘭油烯（9.16%）、芐醇（8.16%）、α-蒎烯（7.35%）、（+/-）-順式-金剛烷烯（7.01%）、欖香烯（5.7%）、雙環(huán)菊酯（4.89%）、芳樟醇（2.58%）。研究表明臘梅花中的天然產(chǎn)物如山奈酚、槲皮素、阿魏酸等均具有良好的藥理作用，β-石竹烯具有特殊香味，同時(shí)還有一定的抗焦慮和抗抑郁作用，因此臘梅花可作為藥劑和化妝品香水的天然原料，或可衍生至養(yǎng)生保健食品等領(lǐng)域，是一種可利用價(jià)值極高的天然資源。