王維貴，郭路，劉曉程，顧超，李斌

1.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海 200011；2.上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；3.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院，上海 200032

隨著人口老齡化的加劇，對(duì)衰老的研究越來越受到社會(huì)的關(guān)注?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，衰老與炎癥相關(guān)，在衰老過程中，組織和器官在機(jī)體中經(jīng)歷一種慢性的和進(jìn)行性的促炎狀態(tài)，長(zhǎng)期慢性炎癥可以誘導(dǎo)卵巢功能減退，引發(fā)過早絕經(jīng)，導(dǎo)致早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）［1-2］。POI 是女性在40 歲之前卵巢功能衰退并逐漸喪失的現(xiàn)象，其特征是出現(xiàn)原發(fā)性閉經(jīng)，或卵巢的原始卵泡過早耗竭導(dǎo)致的繼發(fā)性閉經(jīng)。POI 的發(fā)病率約1%，近年來又升高趨勢(shì)，嚴(yán)重影響女性生殖健康［3］。POI 的病因和發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，約50%以上的患者病因不明［4］。氧化應(yīng)激影響卵泡生成、生長(zhǎng)及成熟過程，在卵巢衰老過程中具有重要的作用［5］。氧化應(yīng)激是激活炎癥小體活化的主要途徑之一，氧化應(yīng)激可通過激活NLRP1 參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病和自身免疫性疾病的發(fā)病過程［6］?？寡趸瘎┮驯怀晒?yīng)用于減少氧化應(yīng)激損傷［7］。二甲雙胍（Metformin，Met）具有抗氧化能力，可改善卵巢功能［8-10］。此外，二甲雙胍還可以通過抑制NLRP炎癥小體途徑保護(hù)細(xì)胞功能，但NLRP1 炎癥小體在二甲雙胍改善卵巢儲(chǔ)備中的作用及機(jī)制尚不清楚［11］。因此，本研究擬在建立雷公藤多苷（Tripterygium glycosides，TG）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷POI 小鼠模型的基礎(chǔ)上，探討二甲雙胍對(duì)卵巢儲(chǔ)備作用，并進(jìn)一步探索NLRP1 等炎癥小體信號(hào)通路參與其作用的機(jī)制，以明確二甲雙胍的抗氧化應(yīng)激作用，并為深入研究POI 的潛在治療靶點(diǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1．1 POI 小鼠模型建立

選取20 只SPF 級(jí)6 周齡雌性C57BL／6 小鼠（購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司），均經(jīng)陰道涂片篩查，動(dòng)情周期正常，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組10 只。實(shí)驗(yàn)組予50 mg／kg／d TG（湖北黃石飛云制藥有限公司）連續(xù)皮下注射35 d，對(duì)照組注射等量生理鹽水［12］。

1．2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及取材

選取40 只SPF 級(jí)6 周齡雌性C57BL／6 小鼠，均經(jīng)陰道涂片篩查，動(dòng)情周期正常，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為TG 組、TG ＋Met 組、Met 組與對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組采用二甲雙胍（購(gòu)自北京京豐制藥集團(tuán)有限公司）進(jìn)行干預(yù)，并隨機(jī)分為：TG 組，予50 mg／kg／d TG 連續(xù)皮下注射及生理鹽水灌胃35 d；TG ＋Met 組，予TG 50 mg／kg／d 皮下注射及Met 100 mg／kg／d 灌胃35 d；Met 組，予生理鹽水皮下注射及Met 100 mg／kg／d灌胃35 d。對(duì)照組予生理鹽水皮下注射及灌胃35 d。每日9 點(diǎn)行陰道脫落細(xì)胞涂片［13］；每周稱量體質(zhì)重；上述處理后取材，稱定質(zhì)重，計(jì)算卵巢指數(shù)（其中卵巢濕重單位為mg，體質(zhì)量單位為g，卵巢指數(shù)單位均為mg／g）［14］；10%甲醛溶液固定卵巢24 h，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE 染色后對(duì)原始卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡、成熟卵泡、黃體及閉鎖卵泡進(jìn)行計(jì)數(shù)［15］。

1．3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

全血收集后于4 ℃離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明書測(cè)定血清促卵泡生成素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、雌二醇（Estrogen，E2）、抗苗勒管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）、IL-1β 及IL-18 的水平。上述試劑盒均購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。

1．4 微板法檢測(cè)血清氧化應(yīng)激指標(biāo)

收集全血，4 ℃離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明書測(cè)定血清丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）的水平變化。上述試劑盒均購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。

1．5 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot，WB）

制備蛋白樣品，BCA 檢測(cè)蛋白濃度，30 μg 蛋白樣品上樣，60 V 電壓跑濃縮膠，120 V 分離膠電泳。330 mA 恒電流轉(zhuǎn)膜90 min，冰水混合物降溫。牛奶封閉60 min，一抗稀釋液NLRP1（1∶2 000，Abcam）、NLRP3（1∶2 000，Abcam）、NF-κB（1∶2 000，Abcam）、NLRP12（1∶2 000，Thermo Scientific）、IL-1β（1∶2 000，Abcam）、IL-18（1∶2 000，Abcam），4 ℃孵育過夜。第2 天室溫?fù)u床孵育二抗60 min，應(yīng)用ECL 超敏發(fā)光液試劑盒配置發(fā)光液，放入發(fā)光儀曝光條帶，測(cè)定各顯色條帶的灰度值，以目的蛋白／內(nèi)參蛋白的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件分析數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．結(jié)果

2．1 氧化應(yīng)激損傷POI 小鼠模型建立

TG 模型組小鼠動(dòng)情周期紊亂，平均動(dòng)情間期延長(zhǎng)，平均動(dòng)情期縮短；此外，TG 模型組小鼠卵巢指數(shù)下降；原始卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡、成熟卵泡和黃體數(shù)量明顯減少，閉鎖卵泡數(shù)量顯著增加；血清FSH 升高，E2和AMH 降低。以上結(jié)果提示，TG 可成功誘導(dǎo)建立POI 小鼠模型。TG 模型組血清抗氧化指標(biāo)SOD、CAT 和GSH-Px 活性下降，氧化指標(biāo)MDA 活性升高，提示氧化應(yīng)激可能參與POI 發(fā)生。見圖1 ～3。

圖1 小鼠陰道脫落細(xì)胞涂片（ ×200）

圖2 TG 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷POI 小鼠模型

圖3 POI 模型小鼠氧化應(yīng)激水平改變

2．2 二甲雙胍可改善小鼠卵巢功能

與TG 模型組相比，TG ＋Met 組小鼠平均動(dòng)情間期縮短，平均動(dòng)情期延長(zhǎng)，卵巢指數(shù)上升，原始卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡、成熟卵泡和黃體數(shù)量上升，閉鎖卵泡數(shù)量下降，血清FSH 水平下降，AMH 和E2水平升高。表明二甲雙胍具有改善氧化應(yīng)激損傷POI 模型小鼠卵巢儲(chǔ)備功能。見圖4～5。

圖4 各組小鼠卵巢組織HE 染色圖片（ ×40）

圖5 二甲雙胍對(duì)POI 小鼠卵巢作用

2．3 二甲雙胍具有抗氧化應(yīng)激作用

與模型組比較，TG ＋Met 組小鼠血清SOD、CAT、GSH-Px 活性升高，MDA 活性下降，提示二甲雙胍可改善小鼠血清氧化應(yīng)激水平。見圖6。

圖6 二甲雙胍對(duì)POI 小鼠血清氧化應(yīng)激水平的影響

2．4 NLRP1 等炎癥小體可能參與二甲雙胍抗氧化改善小鼠卵巢儲(chǔ)備過程

TG 模型組卵巢組織NLRP1 復(fù)合物、NLRP3、NF-κB、IL-1β 及IL-18 均高表達(dá)，NLRP12 低表達(dá)，TG ＋Met 組卵巢組織NLRP1 復(fù)合物、NLRP3、NFκB、IL-1β 及IL-18 表達(dá)下調(diào)，NLRP12 表 達(dá)上調(diào)，這與小鼠血清IL-1β 及IL-18 的變化相一致。以上結(jié)果表明，NLRP1 等炎癥小體信號(hào)通路可能參與二甲雙胍改善氧化應(yīng)激損傷POI 小鼠卵巢功能過程，NLRP12 在小鼠體內(nèi)可能具有保護(hù)作用。見圖7 ～8。

圖7 二甲雙胍對(duì)小鼠卵巢組織NLRP1 等炎癥小體作用

3 討論

POI 的病理生理機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，遺傳、醫(yī)源性、免疫、環(huán)境等多種因素參與其發(fā)生發(fā)展［16］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在POI 動(dòng)物模型中，過氧化產(chǎn)物MDA 活性升高，抗氧化物SOD、CAT、GSH-Px 活性下降，表明氧化應(yīng)激與POI 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［17］。此外，POI 患者血清FSH 與總抗氧化應(yīng)激量（TAS）呈負(fù)相關(guān)，與總氧化應(yīng)激量（TOS）、氧化應(yīng)激指數(shù)呈正相關(guān)［18］。然而氧化應(yīng)激在POI 中作用機(jī)制尚不明確，H2O2常被用于建立氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞模型，但是由于H2O2穩(wěn)定性差，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中研究受限。現(xiàn)已經(jīng)報(bào)道的POI 模型包括基因敲除模型、酶缺陷模型、免疫缺陷模型、化療藥物模型、放射線模型、藥物毒性作用模型等［19］。本課題在既往研究的基礎(chǔ)上，采用TG 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷POI 小鼠模型并對(duì)其驗(yàn)證［12］。

抗氧化劑通過減少或直接清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，在POI 疾病治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。既往研究發(fā)現(xiàn)抗氧化劑褪黑素可通過激活PI3K-Akt 軸抑制FOXO1 減緩顆粒細(xì)胞氧化損傷，白藜蘆醇可以通過降低ROS 水平增加抗氧化基因的表達(dá)，其抗凋亡作用可對(duì)抗衰老卵母細(xì)胞線粒體膜電位下降［20-21］。二甲雙胍是雙胍類降糖藥，被廣泛用于2 型糖尿病治療，能調(diào)節(jié)血糖、血漿內(nèi)胰島素、脂蛋白水平進(jìn)而預(yù)防高脂血癥等并發(fā)癥，其可通過激活A(yù)MPK 通路，抑制下游mTORC1 及降低線粒體ROS 產(chǎn)生減少氧化應(yīng)激損傷和免疫應(yīng)答［22］。在心肌細(xì)胞中，二甲雙胍通過激活A(yù)MPK 通路改善H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷［23］。在年齡相關(guān)性白內(nèi)障中，二甲雙胍可通過激活A(yù)MPK 緩解氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HLE-B3 細(xì)胞衰老［24］。在多囊卵巢綜合征患者中POI 發(fā)生率顯著升高，應(yīng)用二甲雙胍患者POI 發(fā)病率降低，表明二甲雙胍的使用可以降低POI的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［10］。然而目前研究尚未揭示二甲雙胍與POI 的關(guān)系及作用機(jī)制。因此本實(shí)驗(yàn)選擇二甲雙胍對(duì)POI 小鼠模型進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可改善POI 模型小鼠氧化應(yīng)激水平，并且與POI 模型組相比，二甲雙胍聯(lián)合用藥組小鼠平均動(dòng)情間期縮短，平均動(dòng)情期延長(zhǎng)，卵巢指數(shù)上升，原始卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡、黃體數(shù)量上升，閉鎖卵泡數(shù)量下降，F(xiàn)SH 水平下降，AMH 和E2升高。表明二甲雙胍可通過抗氧化作用改善小鼠卵巢功能。

NLRP 炎癥小體是一類通過NOD 樣受體（NODlike receptors，NLRP）傳遞細(xì)胞內(nèi)危險(xiǎn)信號(hào)的多蛋白復(fù)合物，由模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）、細(xì)胞凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）和caspase-1 構(gòu)成，NLRP通常作為一種防御性機(jī)制激活，但當(dāng)機(jī)體受到各種內(nèi)源性和外源性因素被過度刺激時(shí)，模式識(shí)別受體招募并結(jié)合下游的ASC 及caspase-1 或激活NF-κB 信號(hào)通路介導(dǎo)產(chǎn)生IL-1β 和IL-18 炎性因子，引起炎癥持續(xù)發(fā)生可引起組織損傷及器官功能紊亂，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生［25］。目前發(fā)現(xiàn)的炎癥小體主要包括NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP6、NLRP7、NLRP12、AIM2、Pyrin和NLRC4 炎癥小體等［6］。NLRP1 炎癥小體是第一個(gè)被鑒定的，它是由NLRP1、caspase-1 和ASC 構(gòu)成，激活可引起下游的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，近年來研究表明，氧化應(yīng)激可激活NLRP1 炎癥小體參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病和自身免疫性疾病的發(fā)病過程，但在POI 中未有報(bào)道［26］。NLRP3 可增加衰老卵巢中的自噬作用，通過改善自噬延緩衰老和卵巢壽命，且整個(gè)卵泡發(fā)育過程中NLRP3 蛋白在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的定位與炎癥蛋白的定位是一致的［27］。NLRP12 可通過負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB 信號(hào)通路抑制炎癥發(fā)生［28］。在本次研究中，課題組發(fā)現(xiàn)在雷公藤多苷建立小鼠POI 模型中NLRP1 炎性小體復(fù)合物、NLRP3、NFκB、IL-1β 及IL-18 均提示高表達(dá)，血清氧化應(yīng)激水平升高，二甲雙胍干預(yù)保護(hù)后NLRP1 炎性小體復(fù)合物、NLRP3、NF-κB、IL-1β 及IL-18 表達(dá)下調(diào)，血清氧化應(yīng)激水平降低，表明二甲雙胍可通過降低氧化應(yīng)激水平抑制NLRP1 等炎癥小體，進(jìn)而抑制炎癥因子的釋放，從而改善卵巢功能。

綜上所述，二甲雙胍具有抗氧化應(yīng)激作用，其機(jī)制可能是通過抑制NLRP1、NLRP3 等炎癥小體復(fù)合物，減少炎癥因子的產(chǎn)生進(jìn)而改善POI 表型，本研究有助于尋找POI 治療潛在靶點(diǎn)。但是本實(shí)驗(yàn)存在一定的局限性，首先，氧化應(yīng)激在激活NLRP1 的同時(shí)，NLRP3 也參與其調(diào)控，兩者是否具有協(xié)同作用有待進(jìn)一步闡明；其次，本研究是采用二甲雙胍保護(hù)性干預(yù)TG 誘導(dǎo)的POI 動(dòng)物模型，盡管多項(xiàng)研究提示二甲雙胍具有抗氧化應(yīng)激作用，但后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可增加NLRP1的抑制劑或采用NLRP1 基因敲除鼠需進(jìn)一步研究；最后，本文機(jī)制研究較淺，氧化應(yīng)激與炎癥小體及炎性因子之間信號(hào)通路較為復(fù)雜，具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，仍需后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步探索。