董若曦，蔣笑影，陸金根，潘一濱，王佳雯

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院肛腸科，上海 200032

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是1 組原因不明的慢性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn's disease，CD），臨床癥狀可見(jiàn)腹痛、腹瀉和黏液膿血便等［1］。近年來(lái)IBD 的發(fā)病率和患病率呈逐年上升態(tài)勢(shì)。我國(guó)IBD 發(fā)病率逐年上升，預(yù)計(jì)2025年可達(dá)150萬(wàn)人［2］，患病數(shù)居亞洲之首［3］。IBD 多發(fā)于青壯年人群，但近年來(lái)隨著人口老齡化的加速，老年IBD 的患病數(shù)逐年上漲。老年IBD 患者一般病程較長(zhǎng)，易反復(fù)發(fā)作，其治療也受到基礎(chǔ)疾病、服用多種藥物、運(yùn)動(dòng)及認(rèn)知功能受限等原因的制約［4］，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，研究IBD 的發(fā)病機(jī)制及藥物治療至關(guān)重要。目前，傳統(tǒng)IBD 模型動(dòng)物多使用小鼠，可采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）飲水法進(jìn)行造模，但DSS 的濃度缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在嘗試采取不同濃度的DSS 誘導(dǎo)合適的IBD 小鼠模型，為相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康的SPF 級(jí)雌性C57BL6 小鼠40 只，9 周齡，體質(zhì)量（20 ±2）g，購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司「SCXK（滬）2018-0003」，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院動(dòng)物房「SCXK（滬）2008-0036」。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理指南給予動(dòng)物福利并進(jìn)行相關(guān)處理。

1．2 主要試劑和儀器

DSS（分子量36 000 ～50 000，規(guī)格：100g／罐，CAS＃9011-18-1 M.W.）購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals 公司；小鼠糞便隱血試劑組（雙聯(lián)法）BA-2020E，購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；小鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒（EK206／3—96），購(gòu)自上海聯(lián)科生物有限公司。微量移液器（美國(guó)Eppendorf公司）；Synergy H1MF 酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)BioTek 公司；Leica EG1150 包埋機(jī)、Leica RM2235 切片機(jī)、Leica HI1210 攤片機(jī)、Leica HI1220 烘片機(jī)均購(gòu)自德國(guó)Leica Biosystems Nussloch GmbH 公司；Olympus BX43 顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司。

1．3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組

40 只小鼠予全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料，恒溫恒濕適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為5 組：A 組（n=8）自由飲用2.0%DSS，每2 d 換水；B 組（n=8）自由飲用2.5%DSS，每2 d 換水；C 組（n=8），自由飲用3.0%DSS，每2 d 換水；D 組（n=8）自由飲用3.5%DSS，每2 d 換水；E 組（對(duì)照組，n=8），自由飲用滅菌蒸餾水。5 組處理均連續(xù)7 d。

1．4 樣本采集

處理到期后，小鼠禁食不禁水6 h，異氟烷吸入麻醉下摘眼球取血，室溫下靜置1 h 后，3 000 轉(zhuǎn)／min、4 ℃離心10 min，取上清，保存于-80 ℃；取小鼠全結(jié)直腸組織，使用4% 中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片。

1．5 指標(biāo)檢測(cè)

自DSS 給藥后每天進(jìn)行小鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）［5］評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。使用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）檢測(cè)小鼠血清IL-6 水平。取小鼠腸道蠟塊，制作小鼠腸道組織石蠟切片（厚度約5 μm），經(jīng)脫蠟、蘇木素-伊紅染色、脫水、透明后進(jìn)行后續(xù)病理學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0 進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較行t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，組內(nèi)比較予配對(duì)t檢驗(yàn)。所有檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 一般情況比較

實(shí)驗(yàn)前后對(duì)比，對(duì)照組小鼠進(jìn)食量、飲水量無(wú)明顯變化，活動(dòng)敏捷，毛發(fā)光滑；DSS 飲用的各組小鼠，隨著飲用時(shí)間的加長(zhǎng)，絕大部分進(jìn)食、水量逐漸減少，形體逐漸消瘦，反應(yīng)遲鈍不喜動(dòng)，對(duì)外界反應(yīng)淡漠，至給藥結(jié)束時(shí)，D 組小鼠死亡2 只，其他組小鼠未見(jiàn)死亡。

2．2 各組小鼠體質(zhì)量比較

造模前各組小鼠間體質(zhì)量值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后，與對(duì)照組相比，除A 組外（P＜0.05），其他組小鼠間體質(zhì)量均顯著下降（P＜0.01）。DSS 飲用的各組間比較，B、C 組之間體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），D 組體質(zhì)量較B 組下降顯著（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

表2 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與E 組比較，*P ＜0.05、△P ＜0.01；與B 組比較，▲P ＜0.01。

組別 DSS 飲用前 DSS 飲用后A 組（n=8） 20.39 ±1.01 19.03 ±0.60*B 組（n=8） 20.53 ±0.80 18.55 ±1.09△C 組（n=8） 20.85 ±0.57 17.94 ±0.94△D 組（n=6） 20.73 ±0.62 16.52 ±1.84△▲E 組（n=8） 20.23 ±0.30 20.64 ±0.46

2．3 各組小鼠DAI 評(píng)分比較

各組小鼠自造模之日起到取材日，每日行DAI 評(píng)分。第8 天，與對(duì)照組相比，DSS 飲用的各組DAI 評(píng)分均顯著升高（P＜0.01）。DSS 飲用的各組間比較，B、C 組之間DAI 評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），D 組DAI 評(píng)分較B 組升高（P＜0.05），B 組DAI 評(píng)分較A 組顯著升高（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠DAI 評(píng)分比較（±s，分）

表3 各組小鼠DAI 評(píng)分比較（±s，分）

注：與E 組比較，△P ＜0.01，與B 組比較，＃P ＜0.05，▲P ＜0.01。

組別DAI 評(píng)分Day1 Day5 Day6 Day7 Day8 A 組（n=8） 0.04 ±0.12 1.04 ±0.12△ 1.71 ±0.21△ 2.25 ±0.30△▲ 2.50 ±0.25△▲B(niǎo) 組（n=8） 0.08 ±0.15 1.25 ±0.30△ 1.88 ±0.35△ 2.83 ±0.25△ 3.13 ±0.56△C 組（n=8） 0.04 ±0.12 1.63 ±0.21△＃ 2.08 ±0.15△ 3.17 ±0.31△ 3.46 ±0.31△D 組（n=6） 0.00 ±0.00 2.00 ±0.36△▲ 2.50 ±0.6△＃ 3.46 ±0.47△▲ 3.78 ±0.34△＃E 組（n=8） 0.04 ±0.12 0.08 ±0.15 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00

2．4 各組小鼠結(jié)直腸長(zhǎng)度比較

與對(duì)照組相比，DSS 飲用的各組結(jié)直腸長(zhǎng)度均顯著縮短（P＜0.01）。DSS 飲用的各組間比較，B 組小鼠結(jié)直腸長(zhǎng)度較A 組縮短明顯（P＜0.05），B 組與C、D 組小鼠結(jié)直腸長(zhǎng)度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

2．5 各組小鼠血清IL-6 水平比較

與對(duì)照組比較，DSS 飲用的各組小鼠血清白介素6（Interleukin-6，IL-6）水平均顯著升高（P＜0.01）。DSS 飲用的各組間比較，B 組小鼠血清IL-6 水平顯著高于A 組（P＜0.01），C 組小鼠血清IL-6 水平明顯高于B 組（P＜0.05），D 組小鼠血清IL-6 水平顯著高于B 組（P＜0.01）。小鼠血清IL-6 水平與DSS 濃度呈正相關(guān)。

2．6 各組小鼠腸道病理學(xué)指標(biāo)值變化情況

2．6．1 結(jié)直腸組織大體肉眼觀 正常對(duì)照組小鼠結(jié)直腸黏膜呈淡紅色，光滑完整，皺襞清晰，無(wú)出血點(diǎn)。腸道外壁周?chē)梢?jiàn)少量腸系膜及脂肪組織包繞，無(wú)明顯異常改變；DSS 飲用的各組小鼠腸道長(zhǎng)度可見(jiàn)明顯縮短，腸壁增厚，黏膜呈不同程度的充血、水腫，散在出血點(diǎn)，甚至可見(jiàn)潰瘍形成，結(jié)腸組織粘連明顯。

2．6．2 各組結(jié)直腸組織病理學(xué)改變 光鏡下見(jiàn)：正常組小鼠結(jié)直腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊、緊密，隱窩結(jié)構(gòu)正常，以杯狀細(xì)胞為主，偶見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。DSS 飲用的各組小鼠結(jié)直腸黏膜均出現(xiàn)不同程度的病變，且隨著濃度增高而逐漸加重。A 組小鼠結(jié)腸組織黏膜上皮結(jié)構(gòu)排列欠整齊，隱窩結(jié)構(gòu)拉長(zhǎng)，黏膜下層可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。B、C 和D 組小鼠均出現(xiàn)黏膜上皮不同程度的缺損，部分腺體及隱窩結(jié)構(gòu)變形破壞、丟失，可見(jiàn)不同程度的肉芽腫，黏膜及黏膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠腸道組織病理學(xué)改變（HE×200）

2．6．3 腸道組織病理學(xué)評(píng)分比較 與對(duì)照組相比，DSS 飲用的各組小鼠的結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分均顯著升高（P＜0.01）。A 組小鼠的結(jié)腸組織黏膜上皮基本完整，可見(jiàn)部分腺體及隱窩結(jié)構(gòu)變形破壞，黏膜下層可見(jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DSS 飲用的各組間比較，B、C 組腸道組織病理學(xué)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），B 組腸道組織病理學(xué)評(píng)分顯著高于A組，D 組腸道組織病理學(xué)評(píng)分顯著高于B 組（P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠結(jié)直腸長(zhǎng)度、血清IL-6 水平和腸道組織病理學(xué)評(píng)分比較

3 討論

IBD 由遺傳、環(huán)境、免疫、腸屏障功能和腸道微生物等多種因素共同作用所致［6-7］。動(dòng)物模型的合理運(yùn)用，在探索IBD 的發(fā)病機(jī)制及篩選臨床用藥中都具有重大意義。以化學(xué)方式誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型是研究IBD 最主要的造模方法，常用的誘導(dǎo)藥物有2，4，6-三硝基苯磺酸、DSS、噁唑酮、乙酸和碘乙酰胺等，其各有特點(diǎn)［8］。其中，動(dòng)物口服DSS 誘導(dǎo)，由于其造模形成的炎癥程度主要與給藥濃度有關(guān)，而與動(dòng)物攝入量關(guān)系不大［9］，在造模過(guò)程中相對(duì)容易控制，可行性較強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用。其誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的原理是通過(guò)硫酸基團(tuán)造成高負(fù)電荷破壞腸屏障的完整性，使結(jié)腸上皮通透性增加，導(dǎo)致炎癥［10］。此外，DSS 的抗凝血性能加重腸道出血；該模型的病變局限于大腸，尤其是遠(yuǎn)端結(jié)腸，這與UC 相似［11］。該模型是研究腸道環(huán)境，評(píng)估預(yù)防和改善疾病的干預(yù)措施以及藥物篩選的有力工具；為研究宿主遺傳、腸道先天免疫、微生物、飲食和其他環(huán)境因素之間的相互作用與機(jī)制提供支持。但各小鼠對(duì)水的吸收不一致，導(dǎo)致小鼠不一致地暴露在不同的DSS 濃度中。

IL-6 是一種多效型細(xì)胞因子［12］，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，在機(jī)體的抗感染免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［13］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，IBD患者體內(nèi)IL-6 水平明顯升高，炎癥部位的IL-6 水平也明顯升高［14］，通過(guò)循證醫(yī)學(xué)研究進(jìn)一步明確了IL-6 與炎癥的關(guān)系［15］。IL-6 主要調(diào)節(jié)腸道腫瘤細(xì)胞及血管內(nèi)皮因子，促進(jìn)其增殖，其結(jié)合可溶性IL-6 受體（soluble interleukin-6 receptor，sIL-6R） 形成IL-6／SIL-6R復(fù)合物，繼而活化細(xì)胞膜表面的gpl30，誘導(dǎo)STAT3 轉(zhuǎn)錄因子活化促進(jìn)炎癥進(jìn)展［16］。因此可以選用IL-6 作為衡量IBD 發(fā)病及進(jìn)展的重要指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠飲用不同濃度的DSS 后，觀察其一般情況和結(jié)直腸病理學(xué)改變，記錄結(jié)直腸長(zhǎng)度及體質(zhì)量變化，進(jìn)行DAI 評(píng)分和腸道組織病理學(xué)評(píng)分，采用ELISA 檢測(cè)血清IL-6 水平，為模擬IBD 提供了詳細(xì)的小鼠動(dòng)物造模參考。結(jié)果表明，不同濃度的DSS 飲用后，各組小鼠體質(zhì)量明顯下降，呈不同程度的蜷縮不喜動(dòng)、進(jìn)食量下降和體毛晦暗無(wú)光澤等，整體狀態(tài)相對(duì)較差。與對(duì)照組相比，DSS 飲用的各組小鼠體質(zhì)量下降，結(jié)直腸長(zhǎng)度縮短，DAI 評(píng)分和腸道組織病理學(xué)評(píng)分均升高，血清IL-6 水平上升且與DSS 濃度呈正相關(guān)。2.5%、3.0%、3.5% DSS 組表現(xiàn)更為顯著，其中3.5% DSS 組小鼠雖然體質(zhì)量下降、血清IL-6 水平及腸道病理變化最為明顯，但相對(duì)死亡率較高，此濃度不適宜用于誘導(dǎo)造模。2.5%DSS 組和3.0%DSS 組小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降，血清IL-6 水平升高，結(jié)直腸病理學(xué)改變及病理學(xué)評(píng)分均明顯升高，且病理學(xué)改變更加均衡，腸道病理學(xué)改變與IBD 臨床病理學(xué)改變較為貼近，可被認(rèn)為是適宜本研究的IBD 造模方法。出于經(jīng)濟(jì)成本考慮，建議針對(duì)雌性C57 小鼠，2.5%濃度的DSS 是誘導(dǎo)IBD 模型的較佳選擇。