黃挺，沈竹夏，段云嬌，劉佳榛，馮京，孫育民，王駿

復(fù)旦大學(xué)附屬靜安區(qū)中心醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200040

心肌梗死等冠狀動(dòng)脈疾病所引起的心力衰竭（心衰）是老年人生活質(zhì)量下降以及死亡率上升的一個(gè)重要原因［1-2］，而心肌纖維化是引起心肌梗死后心衰的重要機(jī)制［3-4］。心肌纖維化可產(chǎn)生大量α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和膠原纖維，從而增加肌肉組織硬度，降低心臟收縮力，導(dǎo)致致命性心律失常［5］。因此，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化有助于改善老年心衰患者的生活質(zhì)量。目前心衰患者的治療策略主要包括增強(qiáng)心肌收縮力和減少血管收縮，但尚無(wú)一種輔助方法能有效阻止或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的發(fā)展［6］。

克拉拉細(xì)胞10-kDa 蛋白（Clara cell 10-kDa protein，CC10）是由克拉拉細(xì)胞分泌，對(duì)呼吸道炎癥具有抑制作用的分泌性蛋白［7］。研究表明，CC10 與特發(fā)性肺纖維化的聯(lián)系十分密切［8-9］。在特發(fā)性肺纖維化患者與成功誘導(dǎo)肺纖維化疾病模型的小鼠中，CC10在血清與肺組織中的含量上升［10-11］。且CC10 對(duì)特發(fā)性肺纖維化診斷的篩選和預(yù)測(cè)能提供一定有效的信息［12］，這可能與CC10 能夠增強(qiáng)肺纖維化的基因表達(dá)有關(guān)［13］。作為一種肺纖維化的標(biāo)志性蛋白，CC10 在正常心臟中也有表達(dá)［14］，但是否在心肌梗死后的心肌纖維化中也起作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文將探討CC10 與心肌纖維化之間的聯(lián)系，為研究心肌纖維化提供新的切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物和試劑

SPF 級(jí)雄性C57BL／6 小鼠32 只，6～8 周齡，體質(zhì)量20～25 g，自浙江維通利華公司購(gòu)入，許可證號(hào)SCXK（浙）2019-0001，飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。實(shí)驗(yàn)符合復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)要求（202109018S）。小鼠鼠抗CC10 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司（sc-365992）；兔抗Vimentin（VIM）購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司（10366-1-AP）；兔抗CD68購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司（28058-1-AP）；兔抗Cardiac Troponin T（cTnT）購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司（15513-1-AP）；大鼠鼠抗CD31 購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（bs-0195R）；cy3-山羊抗小鼠購(gòu)于中國(guó)賽維爾公司（GB21301）；488-山羊抗兔購(gòu)于中國(guó)賽維爾公司（GB25303）；fitc-山羊抗大鼠購(gòu)于中國(guó)賽維爾公司（GB22302）。

1．2 儀器

7025 型小動(dòng)物呼吸機(jī)（意大利Ugo Basile 公司），R500 型動(dòng)物麻醉機(jī)（深圳瑞沃德公司），Vevo2100 型動(dòng)物心臟超聲檢測(cè)儀（加拿大VisualSonics 公司），5424R 型冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司），9700 型PCR 熱循環(huán)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），LightCycler?480 型實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)設(shè)備（瑞典Roche 公司）。

1．3 實(shí)驗(yàn)分組與造模

將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為模型組與假手術(shù)組，每組16只。模型組小鼠用異氟烷麻醉后，固定于操作臺(tái)上。打開(kāi)小鼠胸腔，7 -0 帶線縫合針結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，結(jié)扎部位位于左心耳下緣1 ～2 mm，排出胸腔內(nèi)多余氣體后縫合小鼠胸腔。假手術(shù)組小鼠不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，其余手術(shù)操作步驟均與模型組相同。自然復(fù)蘇后，將2 組小鼠飼養(yǎng)于同一環(huán)境中，正常飲食。

模型建立后的第7、28 天，2 組各麻醉處死小鼠8只，收集肺與心臟組織。將模型組小鼠心臟分為3 個(gè)區(qū)域：（1）梗死區(qū)（左心室結(jié)扎線以下發(fā)生心梗的區(qū)域）； （2）邊緣區(qū)（圍繞在梗死區(qū)周?chē)囊蝗l死組織）； （3）偏遠(yuǎn)區(qū)（遠(yuǎn)離梗死區(qū)的組織）。假手術(shù)組小鼠心臟分為3 個(gè)區(qū)域：（1）梗死區(qū)（左心耳下緣2 mm下的左心室區(qū)域）；（2）邊緣區(qū)（圍繞梗死區(qū)周?chē)? mm的區(qū)域）； （3）偏遠(yuǎn)區(qū)（遠(yuǎn)離梗死區(qū)的組織）。將小鼠肺組織與分離的心臟組織于-80 ℃冰箱保存。

1．4 免疫組化染色

4%多聚甲醛固定小鼠心臟，透明、脫水處理后石蠟包埋。垂直于心臟行長(zhǎng)軸切片，切片厚度4 μm，55 ℃烘箱過(guò)夜。第2 天透明、脫水處理后，檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，浸泡于3%H2O2中。經(jīng)PBS 洗滌后，3%BSA 室溫封閉30 min。將CC10 一抗1∶100稀釋后，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 洗滌切片3 次，cy3二抗1∶300 稀釋后，室溫孵育50 min。DAB 顯色后復(fù)染細(xì)胞核，脫水、封片，顯微鏡觀察切片。

1．5 Masson 染色

心臟切片脫蠟后，用G1006 型Masson 染液套裝（中國(guó)賽維爾公司）進(jìn)行染色，封片后觀察并拍攝。

1．6 免疫熒光染色

心臟切片脫蠟后行抗原修復(fù)，3%BSA 室溫封閉30 min，將CC10、VIM、CD68、cTnT 和CD31 一 抗1∶100稀釋后，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 洗滌切片3 次，用相應(yīng)的cy3、488 和fitc 二抗1∶300 稀釋后，室溫避光孵育50 min，加入DAPI 復(fù)染細(xì)胞核封片。切片置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1．7 心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

取1～3 d 的C57BL／6 乳鼠，麻醉處死，將其心臟取下。PBS 清洗數(shù)遍后，剪刀剪碎至1 mm 左右碎塊，在37 ℃用0.1%膠原酶Ⅱ消化20 min。離心收集細(xì)胞，在含10%胎牛血清的DME／F12 中培養(yǎng)1.5 h，去除上清液，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)已貼壁的成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)皿底80%～90%后進(jìn)行傳代，取2 ～3 代成纖維細(xì)胞用于接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。

1．8 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將成纖維細(xì)胞按每孔6 ×103個(gè)密度接種于96 孔板中，待細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，換無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓過(guò)夜。加入0、1、10 μM 血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ），在含有10%血清的培養(yǎng)基中孵育48 h 后，使用CCK-8 無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育3 h，酶標(biāo)儀在480 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。

1．9 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）

提取心臟與成纖維細(xì)胞的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司），將RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA 進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件為95 ℃2 min、95 ℃15 s、60 ℃1 min擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt進(jìn)行半定量分析。見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1．10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Image-Pro Plus 計(jì)算CC10 的表達(dá)并定量分析心肌纖維化程度；SPSS 19.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 心肌梗死后CC10 的表達(dá)

與假手術(shù)組相應(yīng)區(qū)域比較，模型組心肌梗死后第7 天梗死區(qū)（13.59 ±5.20）和邊緣區(qū)（5.44 ±1.84）的CC10 mRNA 表達(dá)升高（均P＜0.05）；與假手術(shù)組相應(yīng)區(qū)域比較，模型組心肌梗死后第28 天梗死區(qū)（22.16 ±5.01）和邊緣區(qū)（10.16 ±4.02）的CC10 mRNA 表達(dá)升高（均P＜0.05），α-SMAmRNA 表達(dá)（5.23 ±0.51） 也升高（P＜0.01）。與假手術(shù)組（1.00 ±0.38）比較，模型組心肌梗死后第28 天肺內(nèi)CC10 mRNA 表達(dá)（2.35 ±0.45）升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

心肌梗死后第28 天，與假手術(shù)組［（5.93 ±1.76）%］比較，模型組［（34.54 ±3.77）%］心肌纖維化程度升高（P＜0.01）；與假手術(shù)組相應(yīng)區(qū)域比較，模型組邊緣區(qū)（P＜0.05）和梗死區(qū)（P＜0.01）的CC10平均光密度表達(dá)升高。見(jiàn)圖2。

圖2 CC10 在梗死區(qū)中的表達(dá)（±s，n ＝4）

2．2 CC10 在梗死區(qū)定位的細(xì)胞類(lèi)型

在梗死區(qū)分別進(jìn)行CC10 ＋VIM（成纖維細(xì)胞）、CC10 ＋cTnT（心肌細(xì)胞）、CC10 ＋CD68（巨噬細(xì)胞）及CC10 ＋CD31（內(nèi)皮細(xì)胞）免疫熒光雙染；同時(shí)進(jìn)行CC10 和VIM 免疫熒光單染。結(jié)果顯示，梗死區(qū)中VIM 標(biāo)記細(xì)胞的CC10 細(xì)胞數(shù)略多于cTnT 標(biāo)記的CC10 細(xì)胞，CC10 主要與VIM 標(biāo)記的細(xì)胞共定位，少量與cTnT 標(biāo)記的細(xì)胞共定位，而與CD68 和CD31 不共定位。見(jiàn)圖3。

圖3 CC10 在梗死區(qū)定位的細(xì)胞類(lèi)型

2．3 CC10 在心臟成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

與0 μM AngII（1.00 ±0.02）比較，1 μM（1.19 ±0.01）、10 μM（1.24 ±0.01）AngII 能刺激心臟成纖維細(xì)胞增殖（均P＜0.001）。與0 μM AngII（1.00 ±0.04）比較，1 μM（1.38 ±0.20）、10 μM（1.93 ±0.41）AngII 時(shí)心臟成纖維細(xì)胞內(nèi)CC10 mRNA 表達(dá)增加（均P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 CC10 在心臟成纖維細(xì)胞中的表達(dá)（±s，n ＝3）

3 討論

小鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎手術(shù)是研究心肌梗死后心室重構(gòu)和心衰的常見(jiàn)模型，術(shù)后心臟的病理變化能夠很好地模擬人類(lèi)心肌梗死的病理表現(xiàn)［15-16］。此次研究對(duì)雄性C57BL／6 小鼠造模，術(shù)后發(fā)現(xiàn)模型組小鼠梗死區(qū)的心肌細(xì)胞大量凋亡并伴有纖維瘢痕組織生成，邊緣區(qū)心肌細(xì)胞明顯萎縮，這與既往的動(dòng)物造模結(jié)果一致［17］。

心肌梗死后第7、28 天，與假手術(shù)組比較，模型組CC10 mRNA 在邊緣區(qū)和梗死區(qū)的表達(dá)遞增。伴隨著α-SMAmRNA 表達(dá)在模型組梗死區(qū)增多，CC10 mRNA 的表達(dá)也在梗死區(qū)相應(yīng)遞增。α-SMA 是心臟成纖維細(xì)胞分泌的標(biāo)志性蛋白，表現(xiàn)了心肌梗死后心臟成纖維細(xì)胞由于應(yīng)激而出現(xiàn)的遷移性和增殖性，反映了心肌纖維化的嚴(yán)重程度［18］。通過(guò)Masson 染色，本研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死后第28 天，模型組小鼠的梗死區(qū)呈陽(yáng)性結(jié)果，膠原蛋白含量上升，表明心肌纖維化程度嚴(yán)重。免疫組化結(jié)果表明，在邊緣區(qū)和梗死區(qū)的CC10 蛋白表達(dá)也遞增?？梢?jiàn)隨著心肌梗死后心肌纖維化加重，CC10的表達(dá)在基因、蛋白和組織層面都逐漸上升。

心衰是心肌梗死的常見(jiàn)并發(fā)癥［19］。心衰引起左心房壓力升高，進(jìn)而導(dǎo)致慢性肺水腫、肺功能障礙以及組織纖維化形成［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后第28天模型組小鼠肺內(nèi)的CC10 mRNA 表達(dá)上升，這與心肌梗死后心衰造成的肺纖維化結(jié)果一致。CC10 是一種主要由肺非纖毛支氣管上皮細(xì)胞所分泌的蛋白質(zhì)，與肺的纖維化密切相關(guān)［7］。CC10 的表達(dá)在特發(fā)性肺纖維化中增加，CC10 陽(yáng)性的浸潤(rùn)性細(xì)胞也同時(shí)與轉(zhuǎn)化生 長(zhǎng) 因 子-β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）和膠原蛋白1A1（collagen type I alpha-1，COL1A1）共定位［21］。由此，推測(cè)在肺纖維化進(jìn)展中，成纖維細(xì)胞也表達(dá)一定量的CC10。

心臟梗死區(qū)內(nèi)主要存在的細(xì)胞有成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、存活的心肌細(xì)胞和少量的巨噬細(xì)胞等［22］。此次研究發(fā)現(xiàn)，梗死后第28 天部分成纖維細(xì)胞（VIM 陽(yáng)性）可表達(dá)CC10。cTnT 作為心肌細(xì)胞標(biāo)志物，其陽(yáng)性表達(dá)的少量細(xì)胞也能同時(shí)表達(dá)CC10，但CC10 與成纖維細(xì)胞共定位更多。雖然VIM 蛋白可以識(shí)別成纖維細(xì)胞，但它同時(shí)也能識(shí)別巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞［23］。本研究用CD31 與CD68 分別作為巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物，與CC10 免疫熒光雙染，從而區(qū)分成纖維細(xì)胞與其他細(xì)胞類(lèi)型。結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞（CD31 陽(yáng)性）與巨噬細(xì)胞（CD68 陽(yáng)性）不表達(dá)CC10。因而推測(cè)CC10 的表達(dá)主要定位于梗死區(qū)的成纖維細(xì)胞，這與CC10 陽(yáng)性浸潤(rùn)性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)TGF-β1 和COL1A1 的文獻(xiàn)報(bào)道相符［21］。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證CC10 與心臟成纖維細(xì)胞的關(guān)系，此次研究從新生小鼠體內(nèi)提取原代心臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。經(jīng)CCK-8 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AngII 能夠刺激心臟成纖維細(xì)胞的增殖。同時(shí)，成纖維細(xì)胞中CC10 mRNA 的表達(dá)也增加，說(shuō)明伴隨成纖維細(xì)胞的增殖，成纖維細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的CC10 也在不斷增加。

綜上所述，CC10 主要由梗死區(qū)的成纖維細(xì)胞表達(dá)，隨著心肌纖維化程度加重與成纖維細(xì)胞增殖，CC10 表達(dá)也相應(yīng)上升。伴隨年齡增長(zhǎng)，心肌梗死后心肌纖維化程度加重，老年人更容易發(fā)生心肌纖維化［24］。本研究一定程度上闡述了CC10 與心肌梗死后心肌纖維化的關(guān)系，為干預(yù)心肌纖維化提供了新的靶點(diǎn)，但CC10 是否促進(jìn)心梗后心肌纖維化仍需進(jìn)一步深入研究。