郝星海，張崢，夏牧秋，石夢(mèng)瑤，秦紀(jì)寧，丁云橋*

齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）化學(xué)與化工學(xué)院（濟(jì)南 250353）

漁業(yè)生產(chǎn)的水產(chǎn)品加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量下角料，若不進(jìn)行妥善處理，會(huì)對(duì)環(huán)境造成不良影響[1]。魚(yú)鱗是水產(chǎn)品加工過(guò)程中主要廢料之一，研究分析表明其內(nèi)含有豐富的礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)含量占魚(yú)鱗總質(zhì)量的一半以上，其中以膠原蛋白含量最為豐富[2]。魚(yú)鱗膠原來(lái)源廣泛，魚(yú)鱗中提取膠原不僅能減少環(huán)境污染，還能解決口蹄疫、瘋牛病等帶來(lái)的膠原蛋白安全性問(wèn)題。將魚(yú)鱗“變廢為寶、重新利用”不僅可以避免發(fā)生安全性問(wèn)題，還可以提升魚(yú)產(chǎn)品的附加值[3-5]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)鰱魚(yú)、鳙魚(yú)、羅非魚(yú)等進(jìn)行膠原提取脫鈣工藝的優(yōu)化[6-8]，對(duì)草魚(yú)魚(yú)鱗脫鈣工藝的研究相對(duì)較少。草魚(yú)作為淡水魚(yú)中的“四大家魚(yú)”之一，人工養(yǎng)殖多，繁殖快[9]，魚(yú)鱗約占魚(yú)體比重2.5%，其中含有豐富的膠原蛋白，可作為膠原提取的重要原料，且易獲價(jià)廉[10-12]。

魚(yú)鱗中含有大量礦物質(zhì)，如磷酸鹽、碳酸鹽、羥基磷灰石等，以羥基磷灰石占比最高，且與膠原蛋白粘附緊密，難以分離，這極大影響了膠原蛋白提取率[10]。所以，脫鈣工藝的優(yōu)化成為魚(yú)鱗膠原提取的關(guān)鍵。常見(jiàn)魚(yú)鱗脫鈣方法有酸法和螯合法[13-14]。螯合劑EDTA價(jià)格昂貴，不適用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，而鹽酸作為一種強(qiáng)酸，會(huì)使一部分膠原蛋白流出，造成損失，導(dǎo)致其經(jīng)濟(jì)效益的降低[15]。

采用弱酸檸檬酸為脫鈣劑，結(jié)合超聲波的空化作用，在液體中產(chǎn)生巨大的壓力迫使鈣離子溶出，縮短脫鈣時(shí)間，提高脫鈣效率。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，在確保膠原蛋白低損耗的情況下，確定最佳脫鈣工藝。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

草魚(yú)魚(yú)鱗（收集于濟(jì)南市市中區(qū)海鮮大市場(chǎng)，清洗干凈，晾干備用）。

氯化鈣（天津市登科化學(xué)試劑有限公司）；對(duì)二甲氨基苯甲醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氨水、氯化銨、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、檸檬酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙酸鈉、硫酸、異丙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；L-羥基脯氨酸（純度99%）、鉻黑T、氯胺T（上海麥克林生化科技有限公司）；所用試劑均為分析純。

BSA124S賽多利斯高精度分析天平（上海錫為科學(xué)儀器有限公司）；雷磁PHSJ-4A實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（上海儀電科學(xué)股份有限公司）；DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-2600紫外-可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)脫鈣率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g魚(yú)鱗，置于50 mL燒杯中，控制檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、料液比1∶20 g/mL、超聲功率為200 W。在上述條件下，探究超聲時(shí)間（30，40，50，60，70，80和90 min）對(duì)脫鈣率的影響，以羥脯氨酸溶出率做評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.1.2 檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)脫鈣率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g魚(yú)鱗，置于50 mL燒杯中，控制超聲時(shí)間1 h、料液比1∶20 g/mL、超聲功率為200 W。在上述條件下，探究檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（3%，4%，5%，6%，7%，8%和9%）對(duì)脫鈣率的影響，以羥脯氨酸溶出率做評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.1.3 料液比對(duì)脫鈣率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g魚(yú)鱗，置于50 mL燒杯中，控制超聲時(shí)間1 h、檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、超聲功率為200 W。在上述條件下，探究料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35和1∶40 g/mL）對(duì)脫鈣率的影響，以羥脯氨酸溶出率做評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.1.4 超聲功率對(duì)脫鈣率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g魚(yú)鱗，置于50 mL燒杯中，控制超聲時(shí)間1 h、檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、料液比1∶20 g/mL。在上述條件下，探究超聲功率（100，125，150，175，200，225和250 W）對(duì)脫鈣率的影響，以羥脯氨酸溶出率做評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取最優(yōu)值及最優(yōu)值兩側(cè)數(shù)值作為3個(gè)水平，選擇超聲時(shí)間（A）、檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、料液比（C）、超聲功率（D）為4個(gè)影響因素進(jìn)行L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

1.2.3 脫鈣率的測(cè)定

1.2.3.1 鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)蔣柏泉等[16]的方法略做修改，將滴定時(shí)補(bǔ)充蒸餾水總體積改為50.0 mL。稱取一定量烘干至恒重的無(wú)水氯化鈣，配制成2 mg/mL的氯化鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0和4.0 mL鈣離子標(biāo)準(zhǔn)液于150.0 mL錐形瓶中，每瓶?jī)?nèi)準(zhǔn)確補(bǔ)充蒸餾水至總體積50.0 mL，隨后加入5.00 mL氨水-氯化銨緩沖液（pH 10）和3滴鉻黑T指示劑，搖勻后用0.01 mol/L的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。溶液由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為滴定終點(diǎn)，記錄EDTA消耗體積，平行滴定3次，取平均值。分別以EDTA滴定消耗體積為橫坐標(biāo)，鈣離子質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制鈣離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到該曲線的線性回歸方程。

1.2.3.2 魚(yú)鱗中總鈣含量的測(cè)定

將魚(yú)鱗先后放入5% NaCl溶液、0.5 mol/L的Na2CO3溶液中，在一定磁力轉(zhuǎn)速下攪拌12 h，除去魚(yú)鱗表面的脂質(zhì)，晾干后備用。將預(yù)處理好的魚(yú)鱗準(zhǔn)確稱取3.00 g，按料液比1∶20加入1 mol/L鹽酸溶液中，并在室溫下磁力攪拌24 h。處理完成后將液體轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶定容，用0.01 mol/L EDTA溶液進(jìn)行滴定并計(jì)算出鈣離子含量，按式（1）計(jì)算。

式中：T為由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得鈣離子質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為加入鹽酸的體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；M為魚(yú)鱗總質(zhì)量，g。

1.2.3.3 脫鈣液中鈣含量的測(cè)定

取1.00 mL脫鈣液，準(zhǔn)確補(bǔ)充蒸餾水至總體積50 mL，加入5.00 mL氨水-氯化銨緩沖溶液（pH 10）和3滴鉻黑T指示劑。搖晃均勻后用0.01 mol/L的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，當(dāng)溶液由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)達(dá)滴定終點(diǎn)。通過(guò)鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線得出脫鈣液中鈣離子的含量，按式（2）計(jì)算。

式中：T為由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得鈣離子質(zhì)量濃度，mg/mL；V2為加入檸檬酸的體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；M為魚(yú)鱗總質(zhì)量，g。

1.2.3.4 脫鈣率的計(jì)算

依據(jù)脫鈣液中總的鈣離子含量比上魚(yú)鱗中總的鈣離子含量，所得數(shù)值即為脫鈣率C，按式（3）計(jì)算。

式中：A為脫鈣液中鈣離子含量，%；B為魚(yú)鱗中總鈣離子含量，%。

1.2.4 羥脯氨酸溶出率的測(cè)定[17]

1.2.4.1 氯胺T溶液及顯色劑的配制

稱取2.6 g一水檸檬酸、1.4 g氫氧化鈉、7.8 g無(wú)水乙酸鈉配制成pH=6.8的緩沖溶液，加入25 mL的異丙醇，用水定容至100 mL。用上述緩沖溶液溶解1.41 g的氯胺T，配制成氯胺T溶液，此溶液臨用前現(xiàn)配。

稱取5.0 g對(duì)二甲氨基苯甲醛，用17.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的高氯酸溶解，緩慢加入32.5 mL異丙醇，冷卻至室溫備用。溶液臨用前現(xiàn)配。

1.2.4.2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取50 mg羥脯氨酸，用水溶解并加入1滴硫酸溶液（3 mol/L）定容至100 mL容量瓶中，配制成0.5 mg/mL的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

移取5 mL上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至500 mL容量瓶中，用水定容。分別移取上述溶液5，10，15，20和25 mL于50 mL容量瓶中，用水定容，得到不同濃度的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

移取4 mL上述溶液于試管中，加入2 mL氯胺T試劑，混合后在室溫下放置20 min。加入2 mL顯色劑，充分混合后用不透明的塑料薄膜封口，迅速放入60 ℃水浴鍋中加熱20 min，取出后用流動(dòng)水沖洗3 min，在室溫下放置30 min，于558 nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定。每組試樣重復(fù)測(cè)定3次，取平均值后，以羥脯氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，用Excel繪制羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.3 魚(yú)鱗中羥脯氨酸含量的測(cè)定

稱取1.00 g魚(yú)鱗，取30 mL 3 mol/L的硫酸于50 mL燒杯中，在105 ℃干燥箱內(nèi)水解16 h，取出稀釋一定倍數(shù)后，進(jìn)行顯色反應(yīng)和吸光度測(cè)定，方法同1.2.4.2。根據(jù)式（4）計(jì)算出脫鈣液中羥脯氨酸含量。

式中：T’為由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得羥脯氨酸質(zhì)量濃度，μg/mL；V3為加入硫酸體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；M為魚(yú)鱗總質(zhì)量，g。

1.2.4.4 脫鈣液中羥脯氨酸含量的測(cè)定

取一定量脫鈣液稀釋一定倍數(shù)后，進(jìn)行顯色反應(yīng)和吸光度測(cè)定，方法同1.2.4.2小節(jié)。根據(jù)式（5）計(jì)算出脫鈣液中羥脯氨酸含量。

式中：T’為滴定后由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得羥脯氨酸質(zhì)量濃度，μg/mL；V4為脫鈣液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；M為魚(yú)鱗總質(zhì)量，g。

1.2.4.5 羥脯氨酸溶出率的計(jì)算

依據(jù)脫鈣液中總的羥脯氨酸含量比魚(yú)鱗中總的羥脯氨酸含量，所得數(shù)值即為羥脯氨酸溶出率，按式（6）計(jì)算。

式中：Y為脫鈣液中羥脯氨酸含量，%；X為魚(yú)鱗中總羥脯氨酸含量，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

鈣離子濃度和EDTA的體積關(guān)系如圖1所示。鈣離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.009 6x+0.000 7，R2=0.999 8，表明鈣離子濃度與滴定所用的EDTA體積間具有良好線性關(guān)系。

圖1 鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

羥脯氨酸濃度和吸光度關(guān)系如圖2所示。羥脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.175 2x+0.007 7，R2=0.997 5，表明吸光度與羥脯氨酸濃度間有較好線性關(guān)系。

圖2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 超聲時(shí)間對(duì)脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

超聲時(shí)間對(duì)脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響見(jiàn)圖3。隨著超聲時(shí)間增加，鈣離子與檸檬酸分子接觸時(shí)間增加，脫鈣率緩慢增長(zhǎng)，在70 min時(shí)達(dá)到最大值90.4%，隨后緩慢下降。隨著超聲時(shí)間的增加，羥脯氨酸的溶出率始終低于1.68%。說(shuō)明在70 min條件下，魚(yú)鱗的脫鈣效果好，且膠原蛋白損失量少。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

2.3.2 檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響見(jiàn)圖4。隨著檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，脫鈣率緩慢增長(zhǎng)，在6%時(shí)達(dá)到最大值，之后隨濃度增大而緩慢下降。提升反應(yīng)濃度有利于鈣離子與檸檬酸分子反應(yīng)促進(jìn)脫鈣。隨著檸檬酸濃度增加，羥脯氨酸的溶出率一直低于1.29%，膠原蛋白的損失量少。說(shuō)明在檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的條件下，魚(yú)鱗的脫鈣效果較好。

圖4 檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

2.3.3 料液比對(duì)脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

料液比對(duì)脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響見(jiàn)圖5。提取液體積對(duì)脫鈣率的影響較大，料液比1∶10和1∶15 g/mL時(shí)，脫鈣效果非常不理想。隨著料液比增加，脫鈣率逐漸增長(zhǎng)，在1∶25 g/mL時(shí)出現(xiàn)最大值，繼續(xù)增大料液比后緩慢下降。原因可能是在脫鈣液濃度不變的情況下，隨著體積增加，魚(yú)鱗與脫鈣液接觸面積增大，料液比增加至1∶25 g/mL時(shí)，魚(yú)鱗中的鈣離子已與檸檬酸分子充分結(jié)合，脫鈣率不再隨脫鈣液體積的增加而上升。隨著料液比增加，羥脯氨酸溶出率一直低于4.11%。說(shuō)明在料液比1∶25 g/mL條件下，魚(yú)鱗的脫鈣效果較好，且膠原蛋白的損失量較少。

圖5 料液比對(duì)脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

2.3.4 超聲功率對(duì)脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

超聲功率對(duì)脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響見(jiàn)圖6。隨著超聲功率增加，脫鈣率緩慢增長(zhǎng)，而在175～200 W間出現(xiàn)較大漲幅，猜想可能是超聲能轉(zhuǎn)化為熱能促進(jìn)脫鈣，還可能是由于超聲波的空化作用，加速了魚(yú)鱗中的鈣離子進(jìn)入到脫鈣液中，提升了脫鈣率，在達(dá)到200 W最大值后緩慢下降。隨著超聲功率的增加，羥脯氨酸的溶出率一直低于1.75%，說(shuō)明在超聲功率200 W條件下，魚(yú)鱗的脫鈣效果較好，且膠原蛋白的損失量較少。

圖6 超聲功率對(duì)脫鈣率和羥脯氨酸溶出率的影響

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲時(shí)間60，70和80 min，檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，6%和7%，料液比1∶25，1∶30和1∶35 g/mL，超聲功率175，200和225 W進(jìn)行正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)表（見(jiàn)表2）進(jìn)行試驗(yàn)。由正交試驗(yàn)表中極差R可知，影響魚(yú)鱗脫鈣率的因素主次順序?yàn)锳＞C＞D＞B，即超聲時(shí)間＞料液比＞超聲功率＞檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

利用IBM SPSS 26.0進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)中各因素對(duì)草魚(yú)魚(yú)鱗脫鈣率均有影響，其中時(shí)間因素影響顯著（p＜0.05），即超聲時(shí)間是決定脫鈣率的關(guān)鍵性因素。p值越小顯著性越強(qiáng)，影響越顯著。由正交試驗(yàn)方差分析可知，pA＜pC＜pD＜pB，影響魚(yú)鱗脫鈣率的因素主次順序?yàn)锳＞C＞D＞B，即超聲時(shí)間＞料液比＞超聲功率＞檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，與極差的分析結(jié)果一致。

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

由表2可知，理論最優(yōu)為A3B1C3D3，在此條件下試驗(yàn)得脫鈣率為92.7%，低于正交表中第7組數(shù)值93.8%。綜合考慮影響魚(yú)鱗脫鈣的因素水平，選取最優(yōu)參數(shù)組合A3B1C2D2，即超聲時(shí)間80 min、檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、料液比1∶25 g/mL、超聲功率200 W。此條件在正交試驗(yàn)表的第7組出現(xiàn)，測(cè)定脫鈣率為93.8%。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用超聲波輔助檸檬酸的方法對(duì)草魚(yú)魚(yú)鱗脫鈣工藝進(jìn)行優(yōu)化。用單因素試驗(yàn)探究超聲時(shí)間、檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率對(duì)魚(yú)鱗脫鈣的影響，經(jīng)正交試驗(yàn)選取最佳脫鈣工藝。經(jīng)正交試驗(yàn)極差及方差分析可知，決定脫鈣率的4個(gè)因素的影響順序?yàn)槌晻r(shí)間＞料液比＞超聲功率＞檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。最佳脫鈣工藝條件為超聲時(shí)間80 min、檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、料液比1∶25 g/mL、超聲功率200 W時(shí)，脫鈣率可達(dá)93.8%，而羥脯氨酸的溶出率僅1.38%，證明超聲輔助檸檬酸脫鈣效果影響顯著。優(yōu)化后的工藝脫鈣用時(shí)較短，膠原蛋白損耗量少，可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。試驗(yàn)結(jié)果為草魚(yú)魚(yú)鱗脫鈣工藝提供明確的試驗(yàn)參數(shù)，也為魚(yú)鱗膠原蛋白的提取規(guī)模化生產(chǎn)提供良好技術(shù)參考。