宋鴻雁，張 娜，仇保豐，高雪梅，劉 春，劉文斌，朱順星

(1.南通大學(xué)實(shí)驗動物中心，江蘇南通 226001；2.湛江海關(guān)技術(shù)中心，廣東湛江 524000；3.南通海關(guān)，江蘇南通 226004)

天然腸衣(natural casings)是采用健康牲畜的食道、胃、小腸、大腸和膀胱等器官，經(jīng)過特殊加工，對保留的組織進(jìn)行鹽漬或干制的動物組織，是灌制肉制品的衣膜[1]。天然腸衣加工是我國傳統(tǒng)優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，我國也是世界最大的腸衣出口國，全世界近60%的天然腸衣在中國加工[2]。據(jù)統(tǒng)計，僅2018年我國就出口腸衣10.28萬噸，創(chuàng)匯13.65億美元，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷德國、荷蘭、美國和日本等40多個國家和地區(qū)。目前，我國出口腸衣主要為成品鹽漬腸衣。已有研究表明，按照標(biāo)準(zhǔn)工藝來腌制和儲存鹽漬腸衣，能有效殺滅和控制腸衣攜帶的細(xì)菌，除細(xì)菌芽孢外，能使不產(chǎn)芽孢細(xì)菌的污染水低于當(dāng)前的各種限量標(biāo)準(zhǔn)[3-4]。但是，據(jù)統(tǒng)計，2006年—2016年歐盟召回我國輸歐腸衣共計59批，其中10%以上是因為檢出沙門氏菌所導(dǎo)致[5]。另外，有國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，中國出口鹽漬腸衣攜帶還原亞硫酸鹽梭狀芽孢桿菌的芽孢數(shù)量(sulphite-reducingClostridium-spores)存在超過限量標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)象[4]。尤其值得關(guān)注的是，歐洲天然腸衣協(xié)會(European natural sausage casings association，ENSCA)近年來頻繁對出口歐盟的鹽漬腸衣微生物推薦值進(jìn)行更新，且新增了針對蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus，B.cereus)的限量指標(biāo)[6]。由于鹽漬腸衣攜帶的細(xì)菌中60%以上為芽孢桿菌(Bacillus)[7]，且芽孢桿菌的種類繁多，能引起人和動物發(fā)病的致病菌與可用作飼料添加劑的益生菌同時存在，所以應(yīng)該區(qū)別對待。由此可見，我國出口鹽漬腸衣攜帶細(xì)菌總體水平和需氧芽孢菌的情況均需要引起關(guān)注，但截至目前國內(nèi)均未見相關(guān)研究報道。本研究對南通地區(qū)出口鹽漬腸衣的菌落總數(shù)、需氧芽孢數(shù)量及需氧芽孢菌的菌群組成等進(jìn)行測定，為掌握我國出口鹽漬腸衣攜帶細(xì)菌情況提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源及處理 5份鹽漬豬腸衣和5份鹽漬羊腸衣均為2020年—2021年南通腸衣生產(chǎn)加工企業(yè)出口送檢樣品，剪碎、混勻后置-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 平板計數(shù)瓊脂(Plate Count Agar，PCA)，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；葡萄糖胰蛋白胨瓊脂(dextrose tryptone agar，DTA)，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；酵母浸提物和胰蛋白胨，Oxoid公司產(chǎn)品；瓊脂粉，中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組提取試劑盒(TIANamp bacteria DNA Kit)，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；pGEM-T easy vector，Promega公司產(chǎn)品；dNTPs(10 mmol/L)、rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)、DNA Marker DL 2 000、DNA膠回收試劑盒、16S rDNA Bacterial identification PCR Kit，TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 生物安全柜(BSC-1360 ⅡA2)，北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司產(chǎn)品；PCR儀(MyCycler)、瓊脂糖凝膠電泳儀(PowerPac Basic)，Bio-Rad公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-4600SF)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)搖床(THZ-100B)，上海一恒科技儀器有限公司產(chǎn)品；全自動高壓滅菌器(ES-315)，日本Tomy公司產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機(jī)(MIKRO 22R)，德國Hettich公司產(chǎn)品，電熱恒溫培養(yǎng)箱(XP-9272-1A)，上海析譜儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌落總數(shù)的測定 鹽漬腸衣樣品菌落總數(shù)的測定按文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.2.2 需氧芽孢數(shù)量的測定 鹽漬腸衣中需氧芽孢的測定方法參照文獻(xiàn)[9-10]并略作改動，操作方法簡述如下:將樣品解凍后各稱取25 g并分別加入225 mL無菌PBS溶液(pH 7.2)，振蕩混勻后于沸水中放置15 min，流水冷卻后吸取初始懸液1 mL加入無菌平皿內(nèi)，每個樣品做5個平行，同時設(shè)立空白對照，各平板內(nèi)加入適量55 ℃水浴保存的DTA，混勻后靜置，凝固后倒置培養(yǎng)箱內(nèi)55 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h～72 h，5個平板上的菌落數(shù)相加后再乘以2，即為1 g鹽漬腸衣中的需氧芽孢數(shù)量。

1.2.3 需氧芽孢菌的分離鑒定 將1.2.2部分10份鹽漬腸衣的DTA平板分別拿出，各樣品5塊DTA平板上疑似需氧芽孢菌的菌落總數(shù)≤5個的，全部挑取；疑似需氧芽孢菌的菌落總數(shù)>5個的，隨機(jī)挑取5個，合計挑取細(xì)菌41株。將41株細(xì)菌分別用三區(qū)劃線法接種LB瓊脂平板，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h～72 h后，再從各平板挑取單菌落重復(fù)上述操作將細(xì)菌純化3代。挑取單菌落接種LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，36 ℃±1 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，收集菌液用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取細(xì)菌總DNA，以此為模板用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，切膠回收目的條帶并克隆入pGEM-T easy vector，轉(zhuǎn)化DH5α后涂布AIX平板過夜培養(yǎng)，挑取白色菌落用PCR鑒定出陽性克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行DNA序列測定，最后將所得測序結(jié)果輸入http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/進(jìn)行網(wǎng)上比對，尋找16S rDNA同源性最高的且高于97%的已知細(xì)菌，即可確定該需氧芽孢菌的種類。

2 結(jié)果

2.1 菌落總數(shù)的測定結(jié)果

按照文獻(xiàn)[8]的方法分別對10份出口鹽漬腸衣進(jìn)行了菌落總數(shù)測定(圖1)，發(fā)現(xiàn)5份鹽漬羊腸衣的菌落總數(shù)介于50 CFU/g～8.0×102CFU/g之間，5份鹽漬豬腸衣的菌落總數(shù)介于1.4×102CFU/g～2.4×103CFU/g之間(表1)?？傮w而言，出口鹽漬豬腸衣攜帶細(xì)菌的水平要高于出口鹽漬羊腸衣，但是兩種出口鹽漬腸衣的菌落總數(shù)均遠(yuǎn)低于ENSCA推薦的完全可接受的菌落總數(shù)(<1.0×105CFU/g)。

圖1 鹽漬豬腸衣的菌落總數(shù)測定

2.2 需氧芽孢數(shù)量的測定結(jié)果

分別對10份出口鹽漬腸衣進(jìn)行了需氧芽孢數(shù)量的測定，經(jīng)過55 ℃ ±1 ℃培養(yǎng)48 h～72 h發(fā)現(xiàn)，疑似需氧芽孢菌在DTA平板上為黃色菌落，菌落周圍培養(yǎng)基也由紫色變?yōu)辄S色(圖2)。統(tǒng)計顯示，5份鹽漬羊腸衣和的需氧芽孢數(shù)量介于0 CFU/g～26 CFU/g之間，5份鹽漬豬腸衣的需氧芽孢數(shù)量介于4 CFU/g～1.2×102CFU/g之間(表1)?？傮w而言，出口鹽漬豬腸衣攜帶需氧芽孢的總體水平也要高于出口鹽漬羊腸衣。

圖2 葡萄糖胰蛋白胨瓊脂(DTA)平板上的需氧芽孢菌菌落

表1 鹽漬腸衣菌落總數(shù)和需氧芽孢數(shù)量的測定結(jié)果

2.3 需氧芽孢菌的分離鑒定

從DTA平板上隨機(jī)挑取的41株細(xì)菌經(jīng)純化、16S rDNA測序和分析，顯示為來自芽孢桿菌屬(Bacillus)的11種細(xì)菌，其中熱帶芽孢桿菌(B.tropicus)所占比重最高，約25%(10/41)，另外，高地芽孢桿菌(B.altitudinis)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)等所占比例也較高，為優(yōu)勢菌株(表2和圖3)。值得關(guān)注的是，從2份不同的樣品中各鑒定出1株B.cereus，這是腸衣污染細(xì)菌中被ENSCA認(rèn)定為具有生物危害的細(xì)菌之一。

A.高地芽孢桿菌；B.蘇云金芽孢桿菌；C.巨大芽孢桿菌；D.熱帶芽孢桿菌；E.蠟樣芽孢桿菌；F.副炭疽芽孢桿菌

表2 鹽漬腸衣中需氧芽孢菌的鑒定結(jié)果

3 討論

腸衣是由動物腸管等加工而成，在腸管去糞、清洗、貯存、運(yùn)輸和加工等過程中，難免會受到腸內(nèi)和外界環(huán)境的微生物污染。腸衣污染和攜帶微生物，一方面能夠引起腸衣腐敗變質(zhì)，嚴(yán)重影響腸衣的感官評價和產(chǎn)品質(zhì)量，甚至喪失使用價值，給腸衣加工企業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[11]；另一方面，在腸衣攜帶的微生物中，部分具有潛在生物危害的微生物，如小反芻獸疫病毒、口蹄疫病毒、非洲豬瘟病毒、沙門氏菌、單增李斯特菌、還原亞硫酸鹽梭菌和蠟樣芽孢桿菌等，可對畜牧業(yè)生產(chǎn)或食品安全等造成威脅[4,6,12-15]。因此，國外已對輻射、臭氧、抑菌劑和柵欄技術(shù)等殺滅腸衣微生物開展了大量研究[6-7,16-17]。

利用NaCl腌制(鹽漬)技術(shù)來殺滅和控制腸衣微生物，是腸衣加工和保存中擁有幾百年歷史的傳統(tǒng)工藝[18]。目前國際貿(mào)易中的半成品和成品腸衣絕大多數(shù)是經(jīng)過腌制處理的腸衣。但是，即便是經(jīng)過腌制處理的腸衣也無法完全徹底殺滅所有細(xì)菌，且無法殺滅腸衣中的細(xì)菌芽孢[3-4,7,19]。為了降低腸衣的微生物安全風(fēng)險，ENSCA在2019年6月公布的最新版《ENSCA cGGP revision Ⅷ》中，將沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌等7種細(xì)菌列為腸衣生產(chǎn)中潛在的生物危害，同時對鹽漬腸衣的菌落總數(shù)、腸桿菌數(shù)等提出了嚴(yán)格的限量指標(biāo)[6]。由于歐盟是全球腸衣進(jìn)口的主要市場，僅德國、法國和意大利3個國家的進(jìn)口腸衣量就占全球腸衣貿(mào)易量的62%，我國有近50%的出口腸衣銷往歐盟市場[20-21]。另外，《ENSCA cGGP》早在2013年就被國際天然腸衣協(xié)會認(rèn)可，并被納入其制定的《天然腸衣加工HACCP 手冊》之中。我國作為世界最大的腸衣出口國家且歐盟國家一直是我國的傳統(tǒng)出口市場，但是2007年-2017年我國受通報的出口腸衣達(dá)35批，其中34批(占比97%)是由歐盟技術(shù)壁壘引起[22]。因此，必須立即開展相關(guān)的技術(shù)研究和資料儲備，才能為主動回應(yīng)食品安全問題和破除國外技術(shù)性貿(mào)易壁壘等打下基礎(chǔ)。本研究首先對南通地區(qū)出口鹽漬腸衣的菌落總數(shù)進(jìn)行測定，可為掌握我國出口鹽漬腸衣攜帶細(xì)菌的總體水平提供參考。

NaCl對腸衣細(xì)菌的殺滅效果還會受到鹽漬時間、溫度、鹽濃度(水活度aw)、pH等因素影響[23-24]。另外，對鹽類有抵抗作用的細(xì)菌，特別是耐鹽菌或嗜鹽菌等也可能起腸衣變質(zhì)[4]。因此，不同腌制工藝加工的鹽漬腸衣，其菌落總數(shù)往往會相差甚遠(yuǎn)。Byun M W等[25]對貿(mào)易商新鮮鹽漬的半干腸衣進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)鹽漬豬腸衣的細(xì)菌總數(shù)、腸球菌和大腸菌群分別為 6.78、5.61、5.54 log10CFU/g；鹽漬羊腸衣的細(xì)菌總數(shù)、腸球菌和大腸菌群分別6.61、3.04、3.93 log10CFU/g。Madhwaraj S等[26]對羊腸衣的菌落總數(shù)和嗜鹽菌分別進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)兩者的數(shù)值分別為1.2×103CFU/g和0.9×103CFU/g。ENSCA近年來對鹽漬腸衣加工的標(biāo)準(zhǔn)工藝進(jìn)行了修訂:將經(jīng)過刮制、清洗等加工處理后的動物原腸，用NaCl干鹽(Aw為0.75)或飽和鹽水(Aw為0.75～0.80)密封腌制至少30 d，30 d的腌制期和隨后的儲存期等無需特定的溫度，以便最大程度降低細(xì)菌污染的風(fēng)險[6]。ENSCA目前對鹽漬腸衣菌落總數(shù)的推薦值為<1.0×105CFU/g為完全可接受；5.0×106CFU/g為最大值[6]。中國肉類協(xié)會天然腸衣分會在國內(nèi)腸衣加工出口企業(yè)中宣貫和推行《ENSCA cGGP》已有近10年時間，但當(dāng)前我國出口鹽漬腸衣污染和攜帶細(xì)菌的實(shí)際水平如何，一直未見系統(tǒng)全面的研究和報道。本研究對2020年-2021年南通地區(qū)擬出口的5份鹽漬羊腸衣和5份鹽漬豬腸衣樣品，分別進(jìn)行了菌落總數(shù)測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種鹽漬腸衣的菌落總數(shù)均遠(yuǎn)低于ENSCA的推薦值，說明上述鹽漬腸衣污染和攜帶細(xì)菌的總體水平較低。另外，連續(xù)多年來我國出口鹽漬腸衣罕有因為菌落總數(shù)超標(biāo)而引起國外客戶退運(yùn)事件的發(fā)生，也一定程度上反映了本研究結(jié)果具有較高的可信度。

根據(jù)鹽漬腸衣的原料來源和加工特性，各種細(xì)菌芽孢都可能污染腸衣，對其中致病菌芽孢與益生菌芽孢應(yīng)該區(qū)別看待，因此掌握我國出口鹽漬腸衣攜帶需氧芽孢菌的總體水平及其菌群結(jié)構(gòu)和組成很有必要。本研究對10份鹽漬腸衣的需氧芽孢菌的芽孢數(shù)量進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5份鹽漬羊腸衣的需氧芽孢數(shù)介于0 CFU/g～26 CFU/g之間，5份鹽漬豬腸衣的需氧芽孢數(shù)介于4 CFU/g～1.2×102CFU/g之間(表1)，總體而言，鹽漬腸衣攜帶需氧芽孢數(shù)量相對偏低。課題組經(jīng)過分析，認(rèn)為造成這種現(xiàn)象的原因有兩種可能:一種可能是近年來腸衣肝素鈉價格猛漲，加工中過度刮制和沖洗腸管等操作，導(dǎo)致了本研究所用鹽漬腸衣中需氧芽孢的數(shù)量確實(shí)偏低，此推測與樣品菌落總數(shù)的測定結(jié)果比較一致。另一種可能是檢測方法本身存在的不足導(dǎo)致了上述結(jié)果，目前國內(nèi)外尚未見鹽漬腸衣需氧芽孢計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，與此相關(guān)的研究報道也極少。因此，本研究對國內(nèi)僅有的3項分別用于乳與乳制品[27]、出口食品[9]和化妝品[10]中需氧芽孢計數(shù)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3者主要操作程序基本一致，且所使用的計數(shù)培養(yǎng)基均為DTA，因此綜合參考上述標(biāo)準(zhǔn)并略作改動，對10份鹽漬腸衣樣品分別進(jìn)行了需氧芽孢計數(shù)(表1)。但究竟是何種原因造成需氧芽孢計數(shù)結(jié)果偏低，目前尚無法判斷，這可能需要更多的摸索和研究才能得出結(jié)論。

產(chǎn)芽孢的細(xì)菌是一群差異很大的細(xì)菌，包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus)、梭菌屬(Clostridium)、脫硫腸狀菌屬(Desulfotomaculum)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)和顫螺菌屬(Oscillospira)6個屬，其中芽孢八疊球菌為嚴(yán)格需氧菌，梭菌、脫硫腸狀菌和顫螺菌為嚴(yán)格厭氧菌，而芽孢桿菌和芽孢乳桿菌為需氧、微需氧或兼性厭氧菌[28]。為了研究鹽漬腸衣攜帶需氧芽孢菌的菌群結(jié)構(gòu)和組成，課題組從DTA平板上挑出41株細(xì)菌進(jìn)行了純化和鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們是來自Bacillus的11種細(xì)菌，其中熱帶芽孢桿菌(B.tropicus)、高地芽孢桿菌(B.altitudinis)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)等所占比重也較高，為優(yōu)勢菌株(見表2)。另外，從2份不同的樣品中各鑒定出1株蠟樣芽孢桿菌，這需要引起關(guān)注。綜上可見，出口鹽漬腸衣攜帶需氧芽孢菌的種類較多，其中包括了可引起人和動物發(fā)病的蠟樣芽孢桿菌，估計隨著分離鑒定菌株數(shù)量的增多，將會有更多種細(xì)菌被檢出。