孫新城，許素月，李俠穎，趙成鑫,，胡旭陽，胡金強高 輝,2,3，楊德良，白艷紅,2,3*，張曉根

(1.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，河南鄭州 450001；2.河南省冷鏈食品質量安全與控制重點實驗室，河南鄭州 450001；3.食品生產與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450001；4.長安大學經濟與管理學院，陜西西安710064)

隨著人們生活水平的提高，對于動物蛋白的需求量也越來越大，使得畜牧行業(yè)開始向產業(yè)化大規(guī)模轉型，發(fā)展過程中細菌性疾病的防治成了必須要解決的問題[1]?？咕幬锸腔瘜W合成的一種抗菌類藥物，在畜牧生產過程中對于細菌性疾病具有較好的預防和治療效果。然而抗菌藥物在畜牧養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)性且大批量的使用也逐漸的產生了很多問題，例如細菌的耐藥性、腸道菌群破壞和抗菌藥物殘留等問題，對養(yǎng)殖行業(yè)造成一定損失的同時，也嚴重威脅了人類的身體健康[2]。由于逐年累積的使用抗菌藥物，部分細菌產生了變異，原來的抗菌藥物不能再繼續(xù)發(fā)揮抑制細菌的作用，養(yǎng)殖業(yè)在面對新的變異細菌時不得不承受嚴重損失[3]。在動物生長的過程中如果添加抗菌藥物實現(xiàn)抗病力提高或促進發(fā)育等目的，會極大的擾亂動物本身的免疫調節(jié)能力，停止抗菌藥物的使用會對動物的生長造成嚴重影響，并且對于后代繁衍以及養(yǎng)殖環(huán)境中的菌群平衡都有一定的影響[4]。通常情況下抗菌藥物在動物體內需要一定的時間才能夠完全代謝，如果時間不夠會使得抗菌藥物在肉類等農產品中殘留，最終人類在食用之后對身體健康也會產生影響，抗菌藥物殘留是人們關注的食品安全健康問題之一。

在抗菌藥物濫用問題的背景下，噬菌體作為一種特異且安全的抑菌劑開始被研發(fā)人員所關注。噬菌體自身的基因組較小，但是在宿主菌中卻能產生較大的影響[5]。較小的基因組會使得研究應用的時間大大縮短，操作過程更加簡易，研發(fā)成本也會相應降低。噬菌體本身來自于自然界，只是對特定的菌群產生反應，對原本的生態(tài)菌群不會產生不利影響，是一種環(huán)境友好型的生物抗菌劑，十分迎合當代人提倡的綠色無公害要求。另外，噬菌體會隨著細菌的突變自身也發(fā)生進化，是一個自發(fā)且符合生態(tài)環(huán)境要求的過程，不會產生耐藥性等問題[6]。噬菌體超強的特異性肯定了其安全性，不會在肉、蛋、奶等畜牧產品中殘留，即使人體食用，對腸道內原本的益生菌也無侵染效果，所以噬菌體在畜牧養(yǎng)殖行業(yè)中應用具有較大價值。

1 噬菌體概述

隨著生物技術的不斷發(fā)展，對噬菌體的認識越來越深入，有人把能夠侵襲真菌、藻類、細菌以及放線菌等微生物的病毒都稱為噬菌體。噬菌體廣泛存在于自然界的各種環(huán)境中，幾乎有細菌群落的地方就有噬菌體的存在，有數(shù)據(jù)估計地球上有1031個噬菌體[7]。噬菌體種類多種多樣，并且特異性極高，對于某一種或一類微生物有效，但是對于非目標靶向的其他細菌或者人類是無毒且具有極高的安全性。噬菌體的分類方法也是多種多樣的，根據(jù)噬菌體侵染宿主時的表現(xiàn)分為偽溶原性、溶原性、裂解性和慢性感染4種類型[8]。噬菌體的核酸主要有DNA和RNA兩種，根據(jù)核酸的類型又可以分為單鏈RNA(ssRNA)、單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈RNA(dsRNA)和雙鏈DNA(dsDNA)4種類型。另外，國際病毒命名委員會(ICNV)對噬菌體進行了更加細致的分類，在15個科中大多數(shù)都是有尾噬菌體，根據(jù)尾部的結構更深一步進行了區(qū)分，其中短尾噬菌體占14%，長尾噬菌體科占61%，肌尾噬菌體科占25%[9]。噬菌體的種類多種多樣并且長度變化很大，目前發(fā)現(xiàn)的最短噬菌體24 nm，最長的噬菌體200 nm，T4噬菌體是目前已知的最大的噬菌體。噬菌體的組成較為簡單，幾乎都是由蛋白質外殼和遺傳物質核酸組成[10]。噬菌體的增殖包括吸附、侵入、生物合成、裝配和釋放五個階段，整個過程完全依賴宿主提供必需的物質[11]。吸附是噬菌體侵染宿主的第一步，主要依靠蛋白外殼與宿主細胞外部蛋白特異性結合來實現(xiàn)，一旦特異性蛋白損壞宿主菌就具有了抵抗噬菌體的能力。侵入是通過噬菌體尾部釋放特定的溶菌酶將宿主菌的外膜破壞，然后噬菌體將遺傳物質核酸注入到宿主菌的過程。生物合成是進入到宿主菌的核酸通過宿主體內的各種物質合成自身的mRNA，然后進一步合成早期的蛋白質[12]。等噬菌體的各部件合成后就會進行下一步裝配，將各種蛋白質按照一定程序組裝在一起，大體分為4個階段：頭部裝配、尾部裝配、頭部與尾部裝配、長尾絲裝配[13]。最終組裝好的噬菌體通過釋放內溶素等物質將宿主菌的細胞膜裂解，從而將子代噬菌體釋放出來。

2 噬菌體在畜禽幼齡期的應用

幼齡培育是養(yǎng)殖行業(yè)中的重要環(huán)節(jié)，然而環(huán)境中的感染性細菌無處不在，主要的細菌為大腸埃希氏菌、沙門氏菌、空腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌和產氣莢膜梭菌。一旦感染了細菌性疾病很容易造成幼齡期的動物大量死亡，對養(yǎng)殖場造成較大損失。目前，研發(fā)人員已經分別從養(yǎng)殖過程的各種環(huán)境中分離出多種多樣的噬菌體，采用不同的防治方法去對抗細菌性疾病，且在不同動物的應用過程中取得了較好的效果。

雛雞由于本身免疫系統(tǒng)不夠完全很容易被感染，感染后容易造成生長遲緩，嚴重的會引起大量死亡，研發(fā)人員嘗試使用單一噬菌體或者混合噬菌體的方式對其進行防治。劉功成[14]曾在1日齡的三黃雞日糧中添加了噬菌體，結果表明單一噬菌體能夠有效提升雛雞的成活率。Kim J H等[15]也是從1日齡的肉仔雞開始投喂含有混合噬菌體的飼料，飼養(yǎng)35 d后發(fā)現(xiàn)投喂了混合噬菌體的肉仔雞發(fā)育更好，并且有效抑制了致病菌的感染。曹忠贊等[16]使用噬菌體制劑對感染了沙門氏菌的雛雞進行治療，結果表明在雛雞的肝和盲腸中致病菌的數(shù)量顯著減少，最終雛雞的肝和盲腸都恢復到了正常水平，由此可知在防治雛雞感染沙門氏菌時噬菌體有良好的抑菌效果。Kaikabo A A等[17]也曾采用殼聚糖包被噬菌體的方式對幼齡雞進行治療，使得幼雞的死亡率降低了40%，并且發(fā)現(xiàn)殼聚糖包被使用噬菌體的方法能夠有效提升噬菌體在幼雞體內的存活率。

在仔豬培育的初期，如果受到致病細菌的感染，會導致腹瀉、生長受阻以及成活率降低等眾多不良現(xiàn)象，目前研究者已經試驗了多種噬菌體療法，并取得了較好成果。曾永娣等[18]曾經嘗試給斷奶的仔豬飼料中添加噬菌體，并使用添加抗菌藥物的飼料作為對照，最后發(fā)現(xiàn)飼料中添加噬菌體的仔豬增重更多，并且腹瀉率大大降低，相比于添加抗菌藥物，噬菌體能夠有效提升仔豬腸道中益生菌的活性。Seo B J等[19]的研究表明，當給28日齡的仔豬飼料中添加噬菌體雞尾酒后，仔豬受沙門氏菌感染的風險降低，并且仔豬本身的腸道益生菌活性并未受到影響。Cha S B等[20]給斷奶的仔豬投喂含有1 g/kg噬菌體的飼料，持續(xù)投喂1周后再用腸毒性大腸埃希氏菌進行攻擊，最終發(fā)現(xiàn)投喂噬菌體的仔豬抵抗力有效加強，被腸毒性大腸埃希氏菌感染的幾率下降了約60%。

3 噬菌體在畜禽成長過程中的應用

在畜禽的成長過程中如果被致病菌感染，對于動物的后期發(fā)育以及后期繁殖都會造成很大的影響，極大的提升了養(yǎng)殖成本。研究人員從動物的生存環(huán)境中篩選出具有特異性治療的有益噬菌體，致力于解決各種致病菌的生物防治。

豬在生長過程被致病菌感染會對腸道菌群影響很大，對于飼料中的營養(yǎng)物質難以吸收，產肉率會大大降低。Yan L等[21]曾在豬的生長過程中持續(xù)飼喂了6周的噬菌體，最終檢測發(fā)現(xiàn)豬糞便中沙門氏菌的含量下降很多，并且對于飼料中的干物質和氮源的吸收效果增強。另外Saez A C等[22]采用了微囊包裹噬菌體雞尾酒的方法放在飼料中對生長豬進行投喂，并且與灌喂的方法進行了對比，數(shù)據(jù)顯示微囊包裹的方法效果更好，噬菌體雞尾酒有效的降低了生長豬腸道中的沙門氏菌數(shù)量。

對于牛和羊等產奶類動物，在養(yǎng)殖過程中極易被金黃色葡萄球菌等致病菌感染導致乳腺炎的發(fā)生，抗菌藥物并不能治療被生物膜包裹的致病菌，噬菌體卻能夠穿過生物膜并可以專一性的治療，是較為理想的治療方法。在奶山羊生長發(fā)育的過程中金黃色葡萄球菌會引起乳腺炎，Mishra A K等[23]曾經分離出溶菌性噬菌體對奶山羊中的耐藥性金黃色葡萄球菌進行了治療，結果表明在30 ℃和40 ℃時噬菌體穩(wěn)定并且裂解效果極好。冀亞路等[24]從污水中分離出一種裂解金黃色葡萄球菌的噬菌體，該噬菌體具有較強的殺菌能力，并且具有較寬的宿主譜(64%)，可以用于治療患有乳腺炎的奶牛。Varla-Oritz D F等[25]從患有隱形乳房炎癥的奶牛牛乳中篩選出裂解性噬菌體，數(shù)據(jù)顯示牛乳中的36株金黃色葡萄球菌種大多數(shù)都對抗菌藥物具有耐藥性，而經噬菌體裂解后被殺死的幾率是百分百。

4 噬菌體在肉制品加工中的應用

人們生活品質的不斷提升，對肉、蛋、奶等食品的需求量越來越大，在大規(guī)模生產這些食品的同時預防食源性致病菌的問題也日益嚴重，近年來報道的大腸埃希氏菌、沙門氏菌、李斯特菌等致病菌污染的事件造成巨大經濟損失，同時對食用者的安全也存在威脅[26]。研究人員嘗試著從養(yǎng)殖過程，肉制品生產過程、保藏運輸和銷售等不同時期利用噬菌體進行生物防治，取得了較為理想的效果。

牛肉因為其高蛋白低脂肪的特點被人們廣泛食用，然而被沙門氏菌等致病菌污染的牛肉被食用后，會將感染食用人群，因此預防牛肉感染成為了必須要解決的食品安全問題。David等曾嘗試用噬菌體雞尾酒達到給牛肉滅菌的效果，結果顯示噬菌體雞尾酒的效果優(yōu)于單一噬菌體，并且在4 ℃的環(huán)境中儲存6 d后仍然有很好的滅菌效果[27]。聶若男等[28]篩選出一株裂解性噬菌體，將該噬菌體用于牛肉中鼠傷寒沙門氏菌的防治，在4 ℃和25 ℃兩種條件下進行了抑菌測試，在兩種溫度下牛肉中鼠傷寒沙門氏菌的感染率均降低，表明篩選的噬菌體對牛肉中鼠傷寒沙門氏菌具有良好的抑菌效果。

中國作為一個肉制品消費大國，除了牛肉外對于其他生鮮類的肉制品也是需求量巨大。在生鮮肉的抑菌防治過程中，生鮮肉與噬菌體的接觸面積對于抑菌效果的影響較大，接觸面積越小效果越理想。Sharma C S等[29]使用切碎的火雞肉和整塊的火雞肉做了對比試驗，結果發(fā)現(xiàn)整塊火雞肉的噬菌體抑菌效果要明顯優(yōu)于切碎的火雞肉，分析原因是切碎后表面積增大使得細菌與噬菌體的接觸幾率降低。但是Yeh Y等的試驗結果也證明了噬菌體對于碎肉有抑菌效果，他們將碎肉與噬菌體和致病菌混合揉滾2 h后放于4 ℃的環(huán)境中冷藏，數(shù)據(jù)表明顯著抑菌的時間可持續(xù)6 h[30]。另外，在一些即食食品中噬菌體同樣有較好的殺菌效果。Chang Y等[31]曾使用噬菌體產生的內溶素用于火腿樣品，數(shù)據(jù)顯示在15 min內的抑菌效果較好。

在我國蛋制品也是餐桌上不可缺少的元素，然而如果雞、鴨、鵝等動物在養(yǎng)殖過程被致病菌感染，很可能會對蛋的產量以及蛋的品質有所影響。研究人員曾經篩選出一株裂解能力強并且噬菌譜較廣的噬菌體，經試驗證明對于蛋黃和蛋白中感染的多重耐藥沙門氏菌具有較好的抑制效果[32]。如果鴨在養(yǎng)殖過程中受到沙門氏菌的感染，在鴨肉被感染的同時產出的鴨蛋也會受到污染，會給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的損失。有學者曾經從鴨場中分離出1株噬菌譜較廣的噬菌體，試驗表明該噬菌體在3 h可以保持較強的噬菌體裂解能力[33]。

5 展望

在對畜牧養(yǎng)殖行業(yè)生態(tài)環(huán)保且安全可靠的高標準要求下，噬菌體治療不產生耐藥性、特異性強、來源廣泛、綠色環(huán)保、研發(fā)容易等等優(yōu)勢會越來越顯著，相信在研究人員的共同努力下，噬菌體制劑會不斷研發(fā)用于各種致病菌的生物防治。但是噬菌體制劑研發(fā)過程也需要解決一些問題，首先用于噬菌體制劑研發(fā)的噬菌體要有較好的穩(wěn)定，不會產生毒素等其他不良物質；其次噬菌體制劑使用的噬菌體最好具有較廣的噬菌譜，能夠同時抑制多種致病菌；再者噬菌體的給藥方式要不斷優(yōu)化，對于某些致病菌來說口服噬菌體的給藥方式并不是特別合適；最后噬菌體的給藥劑量也需要不斷探索。相信在科學技術飛快發(fā)展以及研究水平不斷提高的背景下，噬菌體目前面臨的問題都會被解決，在不久的將來，噬菌體能夠成為一種綠色、安全且高效的生物防治試劑，噬菌體制劑的應用必將對畜牧養(yǎng)殖行業(yè)產生正向且積極的影響，對人類的健康也意義深遠。