董源源

摘要 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）可導(dǎo)致多種感染病。萬古霉素是治療感染的最后藥物，隨著耐藥性不斷增加，發(fā)現(xiàn)了對萬古霉素耐藥的菌株。本研究通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出具有識別活性的可溶性細(xì)胞壁結(jié)合域（CBD）蛋白，并偶聯(lián)磁珠（MBs）作為捕獲分子，實(shí)現(xiàn)分離。通過裂解細(xì)菌獲得內(nèi)部的ATP催化化學(xué)反應(yīng)，收集釋放的生物發(fā)光（ BL ）信號，定量檢測目標(biāo)細(xì)菌。結(jié)果表明該方法具有簡單、快速診斷MRSA的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;細(xì)胞壁結(jié)合域;生物發(fā)光分析

1. 導(dǎo)論

超級細(xì)菌的耐藥性使診斷與治療變得困難，給公共醫(yī)療資源帶來巨大負(fù)擔(dān)。金黃色葡萄球菌可以引起嚴(yán)重感染，隨著耐藥性增加，很多常用的抗生素都無法用以治療[1]，還可能可引發(fā)疾病。萬古霉素是治療MRSA最后的藥物，但由于存在對其耐藥的MRSA菌株，給治療感染帶來了巨大困難。CBD是革蘭氏陽性菌內(nèi)溶素的組成部分，負(fù)責(zé)識別和結(jié)合細(xì)菌內(nèi)保守板塊，給予了內(nèi)溶素的特異性。每個細(xì)胞上CBD結(jié)合位點(diǎn)高達(dá)107個，結(jié)合能力與抗體相當(dāng)。CBD具有更寬的識別譜且成分僅為蛋白質(zhì)，故具有較高安全保障。本研究表達(dá)出CBD結(jié)合域，以其為生物捕獲探針，利用ATP生物發(fā)光技術(shù)，建立了一種特異性識別MRSA的新方法，利用ATP提取液可以使MRSA分解，進(jìn)行在實(shí)際樣中的應(yīng)用。

2.實(shí)驗

2.1儀器：蛋白純化儀來自GE，化學(xué)發(fā)光檢測儀來自Remax，熒光顯微鏡來自Nikon Instruments，酶標(biāo)儀來自Molecular Devices，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)來自SCIENTZ，雙系統(tǒng)超低溫冰箱來自中科都菱。

2.2實(shí)驗方法

（1）CBD蛋白的大量表達(dá)純化：預(yù)表達(dá)后大量表達(dá)蛋白，取8 mL過夜菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，加IPTG至其最終的濃度為0.5 mM后。離心15 min收集菌體并復(fù)溶于PBS 中。加蛋白酶抑制劑使終濃度為1 mM。將混合液置于冰水混合物中超聲破菌，離心機(jī)在4 ℃下以4000 rmp 離心40 min，上清用0.45 ?m無菌濾器過濾。（2）CBD對MRSA的廣譜識別能力測定：取1 mL MRSA菌液，離心3 min后棄去上清并收集沉淀，復(fù)溶于PBS中，加入10 ?L GFP-CBD，避光反應(yīng)30min。再將染色細(xì)胞以5000 rmp離心3 min，去除上清，將沉淀復(fù)溶于PBS。將制得的成片置于熒光顯微鏡下，隨后在明場和綠色熒光通道下觀察。（3）CBD-MBs 的制備：取80 ?L MBs懸浮液置于在磁力架上，用10 mM MES緩沖液洗滌后，將洗滌好的MBs加入到1 mL MES 緩沖液中，于37℃反應(yīng)1 h后，將MBs重新分散于2 mL CBD溶液中，在4℃下過夜避光反應(yīng)。將反應(yīng)完成的反應(yīng)液PBS洗滌3次，再將偶聯(lián)完成的CBD-MBs 重新分散于封閉液中，于室溫下反應(yīng)30 min。（4）MRSA的檢測：取1 mL的MRSA菌液加60 ?L的CBD-MBs 懸浮液，在37℃下孵育1 h，加入100 ?L ATP提取液反應(yīng)2 min，再加入100 ?L β-CD（tris-HCl），反應(yīng)1 min取50 ?L反應(yīng)液至微孔中，加入發(fā)光底液以觸發(fā)BL信號。

2.3結(jié)果與討論

2.3.1 MRSA的檢測的原理：CBD-MBs通過所建立的磁分離技術(shù)富集實(shí)際樣中的MRSA，CBD可以與細(xì)菌細(xì)胞壁上保守表位結(jié)合，形成非共價鍵與CBD特異性的結(jié)合，聯(lián)用磁性分離方法，迅速富集并分離MRSA。裂解液使細(xì)菌裂解，導(dǎo)致ATP釋放，釋放的ATP與基于螢光素的BL試劑溶液反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的BL信號。

2.3.2 CBD的廣譜識別能力：綠色熒光通道下，MRSA菌株表面上均發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，與明場下細(xì)菌的位置可以重疊，但在MSSA菌株上并不能觀察到綠色熒光。證明CBD可以廣譜識別所有MRSA 菌株類型，并排除來自MSSA菌株干擾，為其臨床應(yīng)用帶來可能。

2.3.3 MRSA的檢測：用ATP生物發(fā)光技術(shù)，收集釋放的BL，信號范圍為1.0×103 CFU mL-1-1.0×107 CFU mL-1，對于低中高濃度MRSA進(jìn)行相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分析，其RSD值分別為0.6%，2.1% 和0.1%（n = 3），檢測性能表示式：

2.3.4基于CBD檢測方法的特異性：選用三種革蘭氏陽性菌及三種革蘭氏陰性菌，所有待測干擾菌和MRSA的濃度均為1.0×106 CFU mL-1。DI值分別為1.1%、1.2%、1.1%、0.8%、1.3%和1.0%，混合物1為0.3%，包含這6種干擾菌和MRSA的混合液2的BL信號與單獨(dú)含有MRSA的BL信號強(qiáng)度差異為8%，說明沒有干擾，CBD有高度特異性，只能識別MRSA 菌株。干擾度計算方程式：

2.3.5實(shí)際樣品檢測：對尿液與生理鹽水樣品都進(jìn)行2種濃度的檢測，回收率均在 83.0% - 110.0%間，RSD值均不超過8.6%，故該方法適用于各類樣品中MRSA檢測。

3. 結(jié)論

本研究將CBD作為生物識別試劑，偶聯(lián)磁分離技術(shù)，對目標(biāo)細(xì)菌的快速分離，通過ATP生物發(fā)光技術(shù)收集釋放的BL信號來定量檢測，建立了一種快速準(zhǔn)確的檢測方法，可應(yīng)用到實(shí)際樣品檢測MRSA 的含量，在實(shí)際診斷中有巨大潛力。

基金項目：國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助（項目編號：202110635110）

參考文獻(xiàn)

[1] Huskins， W. C.; Goldmann， D. A. Controlling meticillin-resistant Staphylococcus aureus， aka “Superbug”. Lancet 2005， 365（9456）， 295-297.2E02E538-F772-4947-BDDE-EE3300E4F93E