黃愛妮，王洪斌，嚴(yán)碧云，梅大佐，趙昕，向夢(mèng)甜

(1.武昌工學(xué)院 城市建設(shè)學(xué)院，武漢 430065；2.湖北華貴食品有限公司，湖北 洪湖 433200)

菱角，又名腰菱、水栗、菱實(shí)，屬菱科菱屬，是一年生草本水生植物菱的果實(shí)，有幾千年的栽培歷史，盛產(chǎn)于中國(guó)南方，多地繁殖，年產(chǎn)量大。菱角果實(shí)外果皮則為菱角皮，成熟后的顏色呈紫紅至黑色，含有豐富的色素[1]。

目前市場(chǎng)上使用的色素主要包括天然色素和合成色素，但部分合成色素會(huì)對(duì)人體的健康造成一定的危害，甚至有致畸、致癌的風(fēng)險(xiǎn)。因此，天然色素受到了越來越多的關(guān)注[2-5]。許多可食用植物來源的天然色素含有人體自身無法合成的必需營(yíng)養(yǎng)素，植物來源的天然色素不僅可以改善食物呈現(xiàn)的顏色，也能起到補(bǔ)充人體必需營(yíng)養(yǎng)素的作用[6-9]。在醬油、番茄醬、辣椒醬等調(diào)味品的加工中往往需要加入一定量的色素來調(diào)節(jié)顏色，有研究表明植物源天然色素具有穩(wěn)定性好、著色能力強(qiáng)、安全性高等諸多優(yōu)點(diǎn)，在調(diào)味品中的應(yīng)用前景廣闊[10-15]。菱角皮材料來源廣泛，價(jià)格低廉，將其作為著色劑和添加劑用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)，可以豐富天然色素的種類，也可以為菱角皮的加工提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菱角：由湖北華貴食品有限公司提供，剝皮曬干，經(jīng)超微粉碎過60目篩后儲(chǔ)藏備用。

JY-1000A高速多功能粉碎機(jī) 浙江省永康市象珠松青五金廠；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司；GM-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰邦西儀器科技有限公司；HH-2數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；THZ-82B離心機(jī) 金壇市醫(yī)療儀器廠；UV-1800紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 菱角皮紅色素提取方法的比較與選擇

1.2.1.1 乙醇溶液提取

取一定量超微粉碎后的菱角皮粉于錐形瓶中，加入50 mL 95%乙醇溶液，在集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中以60 ℃水浴加熱攪拌1 h后，取出錐形瓶，以2000 r/min的速度在離心機(jī)中離心10 min，取離心管中的上清液，在538 nm處測(cè)吸光值。

1.2.1.2 石油醚∶丙酮(體積比2∶1)混合溶液提取

取一定量超微粉碎后的菱角皮粉于錐形瓶中，加入100 mL石油醚∶丙酮(體積比2∶1)混合溶液，在集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中以60 ℃水浴加熱攪拌1 h后，取出錐形瓶，以2000 r/min的速度在離心機(jī)中離心10 min，取離心管中的上清液，在538 nm處測(cè)吸光值。

1.2.1.3 超聲波輔助乙醇溶液提取

取一定量超微粉碎后的菱角皮粉于錐形瓶中，加入50 mL 95%乙醇溶液，在超聲波中以溫度60 ℃、功率600 W的條件提取1 h，取出錐形瓶，以2000 r/min的速度在離心機(jī)中離心10 min，取離心管中的上清液，在538 nm處測(cè)吸光值。

1.2.1.4 超聲波輔助石油醚∶丙酮(體積比2∶1)混合溶液提取

取一定量超微粉碎后的菱角皮粉于錐形瓶中，加入100 mL石油醚∶丙酮(體積比2∶1)混合溶液，在超聲波中以溫度60 ℃、功率600 W的條件提取1 h，取出錐形瓶，以2000 r/min的速度在離心機(jī)中離心10 min，取離心管中的上清液，在538 nm處測(cè)吸光值。

1.2.2 菱角皮紅色素得率的測(cè)定方法

根據(jù)朗伯比爾定律，當(dāng)一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時(shí)，其吸光度與吸光物質(zhì)的濃度c成正比，其表現(xiàn)的顏色越深，吸光值越高。因此，本文以538 nm處菱角皮紅色素提取液的吸光值來評(píng)價(jià)提取效果，即菱角皮紅色素提取液的吸光值越高，表明菱角皮紅色素的得率越高。

1.2.3 菱角皮紅色素提取工藝的優(yōu)化

選擇乙醇溶液作為菱角皮紅色素的提取劑，采用超聲波輔助進(jìn)行提取，以菱角皮紅色素的得率為考察指標(biāo)，分別考察超聲時(shí)間(30，40，50，60，70，80 min)、料液比(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80， g/mL)、乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)、超聲溫度(30，40，50，60，70，80 ℃)、超聲功率(450，600，750，900，1050，1200 W)等因素對(duì)菱角皮紅色素提取效果的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲時(shí)間、料液比、乙醇濃度、超聲溫度4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)菱角皮紅色素的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 菱角皮紅色素穩(wěn)定性的研究

1.2.4.1 溫度對(duì)菱角皮紅色素穩(wěn)定性的影響研究

將5支裝有菱角皮紅色素提取液的比色管分別置于20，40，60，80，100 ℃的水浴中保溫1 h，期間每20 min振動(dòng)一次，分別測(cè)量各提取液的吸光值，考察溫度對(duì)菱角皮紅色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.4.2 光線對(duì)菱角皮紅色素穩(wěn)定性的影響研究

在10支比色管中分別加入10 mL菱角皮紅色素提取液，將它們分成兩組：一組儲(chǔ)存在黑暗的房間，另一組儲(chǔ)存在室外穩(wěn)定的自然光下。每隔1 h從兩組中各取1支比色管測(cè)量吸光值，考察光線對(duì)菱角皮紅色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.4.3 pH值對(duì)菱角皮紅色素穩(wěn)定性的影響研究

在11支比色管中分別加入10 mL菱角皮紅色素提取液，分別調(diào)節(jié)色素溶液的pH值為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，在室溫下保持1 h，期間每20 min振動(dòng)一次，分別測(cè)量各提取液的吸光值，考察pH值對(duì)菱角皮紅色素穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菱角皮紅色素提取方法的選擇

分別采用乙醇溶液、石油醚∶丙酮(體積比2∶1)混合溶液、超聲波輔助乙醇溶液、超聲波輔助石油醚∶丙酮(體積比2∶1)混合溶液對(duì)菱角皮中的紅色素進(jìn)行提取，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 菱角皮紅色素提取方法的選擇Fig.1 The selection of extraction methods of red pigment from Trapa natans husk

由圖1可知，以菱角皮紅色素的吸光值為提取效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，超聲波輔助乙醇提取的效果最好，菱角皮紅色素提取液的吸光值為0.304，其次為乙醇溶液提取，提取液的吸光值為0.139，提取效果較差的為超聲波輔助石油醚與丙酮混合提取、石油醚與丙酮混合提取，吸光值分別為0.059和0.058。試驗(yàn)結(jié)果說明菱角皮紅色素在乙醇溶液中的溶解度較高，且采用超聲波輔助有利于提高提取效果。因此，選擇超聲波輔助乙醇溶液提取作為菱角皮紅色素的提取方法。

2.2 菱角皮紅色素提取工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 超聲時(shí)間對(duì)菱角皮紅色素提取效果的影響

以乙醇溶液為提取劑，采用超聲波輔助對(duì)菱角皮中的紅色素進(jìn)行提取，保持其他條件不變，分別調(diào)整超聲時(shí)間為30，40，50，60，70，80 min，測(cè)定提取液的吸光值，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)菱角皮紅色素提取效果的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on extraction of red pigment from Trapa natans husk

由圖2可知，超聲提取時(shí)間對(duì)菱角皮紅色素的提取效果有一定的影響，當(dāng)提取時(shí)間從30 min上升到50 min時(shí)，由于超聲波的空化效應(yīng)，增加了分子的運(yùn)動(dòng)速度和介質(zhì)的穿透力，使溶劑迅速進(jìn)入菱角皮，提取效果逐漸增強(qiáng)。當(dāng)提取時(shí)間超過50 min后，吸光值逐漸下降，主要是由于提取時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致紅色素發(fā)生了分解。因此，選擇菱角皮紅色素提取的最佳超聲時(shí)間為50 min。

2.2.2 料液比對(duì)菱角皮紅色素提取效果的影響

以乙醇溶液為提取劑，采用超聲波輔助對(duì)菱角皮中的紅色素進(jìn)行提取，保持其他條件不變，分別調(diào)整料液比為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80(g/mL)，測(cè)定提取液的吸光值，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對(duì)菱角皮紅色素提取效果的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction of red pigment from Trapa natans husk

由圖3可知，當(dāng)料液比在1∶30～1∶60之間時(shí)，菱角皮紅色素提取液的吸光值逐漸上升，可能是由于隨著乙醇溶液用量的增加，加大了菱角皮與乙醇之間的接觸面，使紅色素能夠被充分提取出來。當(dāng)料液比在1∶60～1∶80之間時(shí)，提取液的吸光值顯著下降。因此，選擇菱角皮紅色素提取的最佳料液比為1∶60。

2.2.3 乙醇濃度對(duì)菱角皮紅色素提取效果的影響

圖4 乙醇濃度對(duì)菱角皮紅色素提取效果的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction of red pigment from Trapa natans husk

以乙醇為提取劑，采用超聲波輔助對(duì)菱角皮中的紅色素進(jìn)行提取，保持其他條件不變，分別調(diào)整乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%、90%，測(cè)定提取液的吸光值，試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

由圖4可知，菱角皮紅色素的提取效果受乙醇濃度的影響較大，當(dāng)乙醇溶液的濃度在40%～60%之間時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，菱角皮紅色素提取液的顏色逐漸加深，吸光值逐漸增大，在乙醇濃度為60%時(shí)達(dá)到最大，此后隨著乙醇濃度的增加，吸光值逐漸減小，可能是由于過高的乙醇濃度降低了菱角皮紅色素的溶解速率。因此，選擇最佳乙醇濃度為60%。

2.2.4 超聲溫度對(duì)菱角皮紅色素提取效果的影響

以乙醇為提取劑，采用超聲波輔助對(duì)菱角皮中的紅色素進(jìn)行提取，保持其他條件不變，分別調(diào)整超聲溫度為30，40，50，60，70，80 ℃，測(cè)定提取液的吸光值，試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 超聲溫度對(duì)菱角皮紅色素提取效果的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on extraction of red pigment from Trapa natans husk

由圖5可知，當(dāng)超聲溫度低于60 ℃時(shí)，菱角皮紅色素提取的吸光值緩慢上升，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)超聲溫度高于60 ℃時(shí)，吸光值逐漸降低，同時(shí)過高的溫度會(huì)使紅色素分解，從而影響了菱角皮紅色素的提取效果。因此，選擇最佳超聲溫度為60 ℃。

2.2.5 超聲功率對(duì)菱角皮紅色素提取效果的影響

以乙醇為提取劑，采用超聲波輔助對(duì)菱角皮中的紅色素進(jìn)行提取，保持其他條件不變，分別調(diào)整超聲功率為450，600，750，900，1050，1200 W，測(cè)定提取液的吸光值，試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

由圖6可知，當(dāng)超聲功率低于900 W時(shí)，菱角皮紅色素提取液的吸光值逐漸上升。功率低于900 W時(shí)，超聲波的振動(dòng)幅度較小，紅色素提取不徹底；高于900 W時(shí)，超聲波的振動(dòng)幅度過大，超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)、熱效應(yīng)等可能破壞紅色素的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取效果不佳。因此，選擇菱角皮紅色素提取的最佳超聲功率為900 W。

2.3 菱角皮紅色素提取工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲時(shí)間、料液比、乙醇濃度、超聲溫度4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以菱角皮紅色素提取液的吸光值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)菱角皮紅色素的提取條件進(jìn)一步優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

由表2可知，影響菱角皮紅色素提取效果的因素主次順序?yàn)锽>C>D>A，即影響最大的因素是料液比，其次是乙醇濃度，影響較小的因素是超聲溫度和超聲時(shí)間。綜合正交試驗(yàn)的數(shù)據(jù)可知，菱角皮紅色素的最佳提取條件為A2B2C2D2，即提取時(shí)間50 min、料液比1∶60 (g/mL)、乙醇濃度60%、超聲溫度60 ℃。

稱取一定量的菱角皮原料，選擇60%乙醇為提取劑，調(diào)節(jié)料液比為1∶60 (g/mL)，在60 ℃下超聲提取50 min，測(cè)得提取液的吸光值為0.823，高于正交表中的最大吸光值，驗(yàn)證了正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的正確性。

2.4 菱角皮紅色素穩(wěn)定性的研究結(jié)果與分析

2.4.1 溫度對(duì)菱角皮紅色素穩(wěn)定性的影響

將提取得到的菱角皮紅色素溶液置于比色管中，分別放置在不同溫度的恒溫水浴鍋中，放置1 h并振蕩3次，隨后測(cè)定吸光值，并觀察菱角皮紅色素溶液顏色的變化，試驗(yàn)結(jié)果見圖7。

由圖7可知，隨著溫度的升高，菱角皮紅色素的吸光值變化很小，說明溫度的變化對(duì)菱角皮紅色素的影響較小，即菱角皮紅色素具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.4.2 光線對(duì)菱角皮紅色素穩(wěn)定性的影響

將提取的菱角皮紅色素溶液分成兩組：一組儲(chǔ)存在黑暗的房間，另一組儲(chǔ)存在室外穩(wěn)定的自然光下。每隔1 h從兩組中各取1支比色管測(cè)量吸光值，試驗(yàn)結(jié)果見圖8。

圖8 光線對(duì)菱角皮紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of light on the stability of red pigment from Trapa natans husk

由圖8可知，菱角皮紅色素在黑暗條件和自然光下，顏色逐漸加深，吸光值逐漸升高，在自然光下的變化趨勢(shì)更明顯。因此，光線對(duì)菱角皮紅色素的穩(wěn)定性有一定的影響，在儲(chǔ)藏中應(yīng)盡量避光保存。

2.4.3 pH值對(duì)菱角皮紅色素穩(wěn)定性的影響

將菱角皮紅色素提取液分別在不同的pH環(huán)境下保持1 h，測(cè)量各提取液的吸光值，試驗(yàn)結(jié)果見圖9。

圖9 pH值對(duì)菱角皮紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of pH value on the stability of red pigment from Trapa natans husk

由圖9可知，隨著pH值的升高，菱角皮紅色素的吸光值逐漸變大，當(dāng)pH達(dá)到9以后吸光值逐漸趨于穩(wěn)定，試驗(yàn)中觀察到色素溶液的顏色逐漸加深，直至變?yōu)樽虾稚?。因此，pH值對(duì)菱角皮紅色素穩(wěn)定性的影響較大。

3 結(jié)論與討論

以菱角皮為原料，比較了乙醇提取、石油醚∶丙酮混合溶液提取、超聲波輔助乙醇提取、超聲波輔助石油醚∶丙酮混合溶液提取4種方法，選擇了超聲波輔助乙醇法作為菱角皮紅色素的提取方法，并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波輔助乙醇提取菱角皮中紅色素的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度60%、料液比1∶60(g/mL)、超聲提取時(shí)間50 min、超聲溫度60 ℃、超聲功率900 W，在此條件下，菱角皮紅色素提取液的吸光值為0.823。對(duì)提取的菱角皮紅色素的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，試驗(yàn)結(jié)果表明，pH值對(duì)菱角皮紅色素穩(wěn)定性的影響較大，光線對(duì)其穩(wěn)定性有一定的影響，溫度對(duì)其影響較小。

菱角皮紅色素的超聲提取工藝較簡(jiǎn)單，提取效果較好，提取得到的紅色素穩(wěn)定性較高，可作為化學(xué)合成色素的替代產(chǎn)品用于調(diào)味品、飲料、酒類等食品的著色，具有很大的市場(chǎng)潛力。