文華英，賈福晨，靳玉龍，張玉紅

西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)與食品科學研究所，西藏拉薩 850000

0 引言

獨特的生存環(huán)境孕育著獨特的生物資源，西藏有“世界第三極”之稱，擁有中國極端環(huán)境條件下寶貴而獨特的微生物種質(zhì)資源[1]。西藏傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶的制作和食用有數(shù)千年歷史，因氣候環(huán)境和地理因素差異大以及制作工藝的不同[2]，孕育出的乳酸菌特性也不同[3]，其中不乏具有優(yōu)良益生特性和生產(chǎn)特性的低溫乳酸菌菌株[2]，其能在低溫環(huán)境下生長、繁殖，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生物修復、污水處理和醫(yī)藥等領域均具有良好的應用[4～6]，尤其在食品工業(yè)和水果加工領域，低溫在節(jié)能以及保留住不穩(wěn)定和易揮發(fā)的風味化合物，防止污染和消除任何殘留的酶活性等方面的優(yōu)勢不斷凸顯[5]，用低溫工藝取代高溫工藝的趨勢一直在增長。

低溫乳酸菌具備保鮮、抑菌和益生功能，可在低溫工藝下發(fā)揮作用，圍繞其開展的低溫發(fā)酵研究涉及發(fā)酵乳制品、青貯飼料、肉制品、泡菜和食品生產(chǎn)等[7，8]。因此，進一步加深對低溫乳酸菌資源的認識和開發(fā)，具有重要意義。篩選特性優(yōu)良的低溫乳酸菌，不僅能為低溫發(fā)酵提供菌種資源儲備，還能為篩選優(yōu)異菌株及其商業(yè)化開發(fā)提供依據(jù)，為我國開發(fā)優(yōu)良直投菌劑提供了有利保障[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗菌株的來源與信息

13 株乳酸菌分離于西藏拉薩市、昌都市、那曲市和日喀則市農(nóng)牧民家采集的傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶樣品，

用MEGA7.0軟件繪制系統(tǒng)進化樹如圖1。

圖1 基于16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯；鳥氨酸脫羧酶生化鑒定管、賴氨酸脫羧酶生化鑒定管、精氨酸脫羧酶生化鑒定管、氨基酸脫羧酶對照生化鑒定管、Kovacs靛基質(zhì)試劑、蛋白胨水、無菌液體石蠟，環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.1.3 主要儀器與設備

生物顯微鏡（UB203i），北京博雅創(chuàng)新科技發(fā)展有限公司；渦旋振蕩器（Vortex.Genie2），美國Scientific Industries公司；分析天平（BS223S），賽多利斯科學儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV7502PCS），上海欣茂儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（LRH-250）、電熱恒溫水浴鍋（HWS-28），上海齊欣科學儀器有限公司；離心機（TGL-16G），上海安亭科學儀器廠；pH酸度計（PH400），安萊立思儀器科技有限公司；等。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液的制備

從平板單菌落挑取一環(huán)試驗菌株至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，活化2～3 次。測定OD600nm值，通過稀釋制備接種濃度為OD600nm值等于0.6的菌液，按3%（v/v）的比例接種。

1.2.2 耐低溫乳酸菌篩選

根據(jù)文獻[10]適當修改，菌液接種至含4 mL MRS液體培養(yǎng)基中，放置于10 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每個試驗組設置3 次重復。分別測定培養(yǎng)2 d、4 d和6 d時的OD600nm值和pH值。

1.2.3 不同溫度下生長情況測試

根據(jù)文獻[10、11]適當修改，菌液接種至含4 mL MRS液體培養(yǎng)基中，每個試驗組設置3 次重復。分別放置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃和45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48～72 h，利用紫外分光光度計測定OD600nm值。

1.2.4 耐鹽特性分析

根據(jù)文獻[12、13]進行改良，制備NaCl濃度為2%、4%、6%和8%的MRS液體滅菌培養(yǎng)基。將菌液接種至4 mL上述培養(yǎng)基中，每個試驗組設置3 次重復。分別放置于30 ℃、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48～72 h，利用紫外分光光度計測定OD600nm值。

1.2.5 耐酸特性分析

根據(jù)文獻[14]進行改良，制備pH值為3、3.5、4和5的MRS液體滅菌培養(yǎng)基。將菌液接種至4 mL上述培養(yǎng)基中，每個試驗組設置3 次重復。分別放置于30 ℃、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48～72 h，利用紫外分光光度計測定OD600nm值。

1.2.6 產(chǎn)酸能力分析

根據(jù)文獻[15]適當修改，將菌液接種至4 mL含6%NaCl的MRS液體培養(yǎng)基無菌離心管中，每個試驗組設置3 次重復。分別放置于30 ℃、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48～72 h，使用pH計測定菌株培養(yǎng)液的pH值。

1.2.7 降亞硝酸鹽特性分析

（1）標準曲線的繪制

根據(jù)《GB5009.33—2016食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中鹽酸萘乙二胺法繪制標準曲線。

（2）菌液中亞硝酸鹽含量測定

根據(jù)文獻[16]適當修改，將菌液接種于2 mL亞硝酸鹽質(zhì)量濃度為125 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中，每個試驗組設置3 次重復。分別放置于30 ℃、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。于24 h和48 h分別取樣，按照標準回歸方程計算亞硝酸鹽含量。降解率按以下公式計算：

式中：X為菌株亞硝酸鹽降解率，%；C0為原培養(yǎng)基中亞硝酸鹽質(zhì)量濃度，μg/mL；C1為測試樣品亞硝酸鹽質(zhì)量濃度，μg/mL；100為換算系數(shù)。

1.2.8 氨基酸脫羧酶試驗和吲哚試驗

氨基酸脫羧酶試驗：根據(jù)文獻[13]進行改良，按照氨基酸脫羧酶生化鑒定管（環(huán)凱）說明書操作。

吲哚試驗：配制5 mL/管的蛋白胨水培養(yǎng)基，高溫滅菌。菌液接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，未接種的蛋白胨水培養(yǎng)基為空白對照，37 ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h。向培養(yǎng)基中滴加5～8 滴靛基質(zhì)試劑，并輕搖試管觀察顏色變化。若液面出現(xiàn)紅色則為陽性結(jié)果，否則為陰性結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）；使用Excel軟件進性數(shù)據(jù)分析并繪制柱狀圖和折線圖，數(shù)據(jù)用平均值±標準誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫乳酸菌初篩

2.1.1 低溫生長能力測試

13 株乳酸菌在10 ℃條件下培養(yǎng)2 天、4 天以及6 天，測定OD600nm值和pH值，統(tǒng)計如表1。從表1可以看出，10 ℃條件下CD3和CD5生長速度最快，OD600nm值高且pH值低的8 株菌分別為CD5、CD3、CD33、RK17、CD14、NQ9、NQ37、CD10，以此8 株菌開展后續(xù)特性分析試驗。

表1 13 株乳酸菌10 ℃條件下培養(yǎng)2 天、4 天及6 天的菌液OD600 nm值和pH值

2.1.2 不同溫度下生長能力分析

共計9 株菌，設置7 個溫度梯度，測試不同溫度下OD600nm值，繪制生長曲線見圖2。結(jié)果顯示：CD3和CD5的生長情況明顯好于其余試驗菌株；其中CD5最適生長溫度為25 ℃，其余均為30 ℃；RK17、CD33對溫度最敏感，RK17在20 ℃后生長迅速，CD33在20～30 ℃條件下生長較為良好，二者在37 ℃時生長明顯下降；RK23在30～40 ℃區(qū)間生長差異不大。因結(jié)果顯示試驗菌株最適生長溫度多為30 ℃，而文獻多以37 ℃為試驗溫度，遂設置30 ℃和37 ℃兩個試驗溫度開展后續(xù)特性研究試驗，對比差異。

2.2 特性研究

2.2.1 耐鹽能力分析

耐鹽能力見表2?？梢钥闯?，在8%NaCl濃度環(huán)境下，30 ℃時，CD3和CD5生長良好，CD14和CD33能生長；37 ℃時，NQ37微弱生長，其余7 株能生長。綜上，30 ℃條件下的CD3和CD5耐鹽性能最好。

表2 不同鹽度條件下8 株乳酸菌的生長特性測定

2.2.2 耐酸能力分析

8 株乳酸菌，設置4個pH梯度，耐酸能力見表3?？梢钥闯?，30 ℃條件下的CD3和CD5耐酸性能最好，其余菌株在pH值3.5及更低pH值條件下均微弱生長或不生長，體現(xiàn)出較差的耐酸性能。

表3 不同pH值條件下8 株乳酸菌的生長特性測定

2.2.3 產(chǎn)酸能力分析

根據(jù)顯著性差異分析，由圖3可以看出，培養(yǎng)溫度不同，產(chǎn)酸能力有所差異，但對CD3和CD5影響較小。綜上，CD5和CD3的產(chǎn)酸能力最強，其次為30 ℃時的CD14和CD33。

圖3 30 ℃和37 ℃培養(yǎng)條件下乳酸菌的pH值對比

2.2.4 降亞硝酸鹽特性分析

根據(jù)1.2.7（1）方法，測定不同濃度亞硝酸鈉標準液在反應后的OD538nm值，繪制得到標準曲線如圖4?；貧w方程為：y=0.7363x，R2=0.9974。

圖4 標準曲線圖

試驗菌株的亞硝酸降解率如圖5。根據(jù)顯著性分析，從圖5可以看出，菌株培養(yǎng)24h時，CD5、CD3、CD10和NQ9體現(xiàn)出較強的亞硝酸鹽降解能力。在37 ℃時，CD5和CD3降解率接近90%，CD10和NQ9降解率接近70%，顯著高于30 ℃時。

圖5 24 h時30 ℃和37 ℃條件下亞硝酸鹽降解率

根據(jù)顯著性分析，從圖6可以看出，菌株培養(yǎng)48 h時，CD5、CD3、CD10和NQ9體現(xiàn)出較強的亞硝酸鹽降解能力。在37 ℃時，CD3和CD5的降解率達99%，CD10和NQ9達85%以上，其次RK17達75%以上。在30 ℃時，CD3和CD5的降解率達97%，與37 ℃時無顯著差異。

綜合圖5和圖6可知，CD3和CD5的亞硝酸鹽降解率最高，其次為CD10和NQ9，且在37 ℃條件下比30 ℃時降解率更高。

圖6 48 h時30 ℃和37 ℃條件下亞硝酸鹽降解率

2.2.5 氨基酸脫羧酶試驗和吲哚試驗

生物胺與吲哚生成結(jié)果如表4所示，8 株試驗菌株的賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶試驗和吲哚試驗反應均為陰性；而精氨酸脫羧酶試驗中CD3、CD5、CD14和RK17反應呈陰性，表明這4 株菌不會將精氨酸經(jīng)精氨酸脫羧酶作用生成精胺對人體造成安全隱患，對比其余4 株陽性結(jié)果菌相對安全。

表4 乳酸菌生物胺與吲哚生成結(jié)果

3 結(jié)論

本研究以從西藏拉薩市、昌都市、那曲市和日喀則市采集的傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶樣品中分離出的13株乳酸菌為試驗菌株。通過10 ℃低溫條件培養(yǎng)篩選出的Lactobacillus paracaseiCD3和CD5，最適生長溫度分別為30 ℃和25 ℃，其耐鹽、耐酸、降亞硝酸鹽特性較好，產(chǎn)酸能力較好，精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸脫羧酶試驗呈陰性，吲哚試驗呈陰性，表明其能適應低溫生長，可在高鹽低pH值的環(huán)境中生長，發(fā)酵時產(chǎn)酸性能較強，在發(fā)酵過程中可降解亞硝酸鹽并且不分解精氨酸、鳥氨酸和賴氨酸，以避免對人體產(chǎn)生危害，可作為低溫發(fā)酵菌種資源。下一步研究將進一步探索CD3和CD5的益生和發(fā)酵等特性，研究其作為直投發(fā)酵菌劑是否具有優(yōu)勢。