吳 雙 戚庭月 王成海

1 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，江蘇省揚州市 225001; 2 江蘇省寶應(yīng)縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科; 3 揚州大學(xué)附屬醫(yī)院超聲科

子宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤。近幾十年宮頸細胞學(xué)篩查的普遍應(yīng)用，使宮頸癌和癌前病變得以早期發(fā)現(xiàn)和治療，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率已有明顯下降[1-2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是長度>200個核苷酸且無編碼蛋白功能的RNA。近年來研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在宮頸癌組織和細胞中表達異常，影響宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲等過程,在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)控作用[2]。lncRNA-DNAJC3-AS1是lncRNA其中的一員。本研究采用RNA原位分子雜交技術(shù)檢測lncRNA-DNAJC3-AS1在宮頸鱗癌組織中的表達情況，分析lncRNA-DNAJC3-AS1的表達水平與宮頸鱗癌病理參數(shù)的相關(guān)性及探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年1月—2021 年6月?lián)P州大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科手術(shù)的73例經(jīng)病理科醫(yī)師證實的子宮頸鱗狀細胞癌癌組織標(biāo)本。患者年齡29～72 歲，中位年齡為52歲。標(biāo)本使用及臨床資料的收集均經(jīng)揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。

1.2 方法 RNA原位分子雜交(RISH)實驗：lncRNA-DNAJC3-AS1探針和原位雜交試劑盒購買于BOSTER生物工程有限公司。主要實驗步驟如下：石蠟切片脫蠟、胃蛋白酶消化；在預(yù)雜交后使用lncRNA-DNAJC3-AS1探針進行雜交，再滴加與lncRNA連接的一抗后，最后滴加二抗。使用DAB顯色，胞核復(fù)染成藍色，光鏡下觀察。lncRNA-DNAJC3-AS1探針序列為AGCGATTGTGGAAGACCCTG和ATTTCCCCTGGTAAGCGCAA。

1.3 觀察指標(biāo) 光學(xué)顯微鏡下觀察lncRNA-DNAJC3-AS1陽性染色情況，結(jié)果判定：細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為lncRNA-DNAJC3-AS1陽性細胞。隨機選擇5個高倍光鏡視野，計算陽性細胞與總細胞數(shù)的比率，<10%為低表達陽性組，10%～100%為高表達陽性組。然后觀察高表達陽性組和低表達陽性組與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，與患者預(yù)后生存的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 RISH檢測lncRNA-DNAJC3-AS1在宮頸鱗癌中的表達 RISH實驗結(jié)果表明，73例宮頸鱗癌組織中l(wèi)ncRNA-DNAJC3-AS1的陽性染色為棕黃(褐)色，顆粒染色深淺不一、大小不等，以細胞漿染色為主；正常宮頸組織中染色極少，主要為陰性表達，見圖1。lncRNA-DNAJC3-AS1在宮頸鱗癌組織中呈陽性表達，約占83.56 % (61/73)；與癌旁正常組織陽性表達(5.48%，4/73)之間有統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=90.096，P<0.05)。

a b c

2.2 宮頸鱗癌組織中l(wèi)ncRNA-DNAJC3-AS1陽性表達及臨床意義 首先將lncRNA-DNAJC3-AS1表達水平分為兩組：低表達組和高表達組，分組依據(jù)是低表達組為陽性率≤10%，高表達組為陽性率10%～100%。結(jié)果得到高表達lncRNA-DNAJC3-AS1 57例，低表達lncRNA-DNAJC3-AS1 16例。通過統(tǒng)計分析得出lncRNA-DNAJC3-AS1表達水平與腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、HPV感染、腫瘤大小和TNM分期之間的無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

2.3 lncRNA-DNAJC3-AS1表達與患者生存預(yù)后的關(guān)系 高表達組中位生存時間(OS)為19個月(四分位區(qū)間 4～27個月)，低表達組中位OS為49個月(四分位區(qū)間23～54個月)。低表達組OS均明顯長于高表達組(χ2=33.85，P<0.05)，見圖2。

3 討論

在全球癌癥中宮頸癌發(fā)病率排名第三，也是發(fā)展中國家最常見的婦科癌癥[3-4]。該病主要與細菌感染、宮頸損傷及HPV持續(xù)感染等密切相關(guān)；目前認為長期宮頸炎可導(dǎo)致宮頸非典型增生(CIN)，進而發(fā)生癌變[5]。宮頸癌和其他癌癥一樣，其預(yù)后不佳與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)，也是宮頸癌患者死亡的主要原因。因此，深入研究宮頸癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，對其診治具有重要意義。

表1 宮頸鱗癌組織中l(wèi)ncRNA-DNAJC3-AS1的表達及其意義

lncRNA異常表達與宮頸癌增殖、凋亡抵抗、侵襲轉(zhuǎn)移等惡性轉(zhuǎn)化基本特征相關(guān)，可作為宮頸癌的診斷新型標(biāo)記物和治療靶點[6-7]。研究顯示lncRNA-DNAJC3-AS1高表達與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良相關(guān)，lncRNA-DNAJC3-AS1通過表皮生長因子受體(EGFR)通路調(diào)控脂肪酸合酶能夠促進結(jié)直腸癌進展[8]。lncRNA-DNAJC3-AS1在透明腎細胞癌中表達上調(diào)，沉默lncRNA-DNAJC3-AS1可減少可抑制透明腎細胞癌細胞增殖和侵襲并誘導(dǎo)細胞凋亡[9]。下調(diào)lncRNA-DNAJC3-AS1表達能夠抑制結(jié)腸癌細胞的EMT、遷移和侵襲[10]。在調(diào)控機制上lncRNA-DNAJC3-AS1通過與miR-144靶向結(jié)合促進乳腺癌細胞增殖和順鉑耐藥[11]。

圖2 lncRNA-DNAJC3-AS1表達與患者預(yù)后的生存曲線圖

目前，還沒有文獻報道lncRNA-DNAJC3-AS1在宮頸癌中的表達情況，其生物學(xué)活性尚未明了，這也是本課題的研究所在。本文通過RISH實驗得出在大多數(shù)宮頸鱗癌組織中l(wèi)ncRNA-DNAJC3-AS1呈陽性表達，而在癌旁正常宮頸組織里呈陰性表達，提示lncRNA-DNAJC3-AS1可能是一種新的宮頸鱗癌的癌變轉(zhuǎn)化基因，其突變激活后可以促進宮頸癌的生長發(fā)育。

在分析高表達陽性的lncRNA-DNAJC3-AS1與宮頸鱗癌患者臨床病理資料的關(guān)聯(lián)性上，通過統(tǒng)計分析表明lncRNA-DNAJC3-AS1與宮頸鱗癌組織的腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，說明強陽性表達lncRNA-DNAJC3-AS1的宮頸鱗癌腫瘤分級程度低，惡性程度高，提示患者的預(yù)后不良，低分化的腫瘤更容易從宮頸原發(fā)病灶向鄰近的淋巴管轉(zhuǎn)移，并向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，晚期甚至于向遠處轉(zhuǎn)移。雖然與患者的年齡、HPV感染、腫瘤大小和TNM分期之間無相關(guān)性，但不排除與我們的標(biāo)本量較少有關(guān)。在lncRNA-DNAJC3-AS1表達水平與宮頸鱗癌患者生存預(yù)后的關(guān)系統(tǒng)計中，低陽性表達lncRNA-DNAJC3-AS1的宮頸鱗癌患者存活時間明顯長于高陽性表達lncRNA-DNAJC3-AS1的患者，這也進一步提示了lncRNA-DNAJC3-AS1可以作為宮頸鱗癌患者預(yù)后判定的一個重要指標(biāo)。至于陽性表達lncRNA-DNAJC3-AS1的宮頸鱗癌細胞有沒有抗藥性，目前我們還沒有實驗數(shù)據(jù)，有待于進一步實驗證實，如有抗藥性，則患者的生存時間短，死亡率高。

綜上所述，本研究結(jié)果說明lncRNA-DNAJC3-AS1可能作為宮頸鱗癌發(fā)生和患者預(yù)后判斷的一種新腫瘤標(biāo)志物。本實驗探討lncRNA-DNAJC3-AS1在宮頸鱗癌中的表達情況及其臨床病理意義，為進一步研究其相關(guān)性功能提供理論依據(jù)，也為宮頸鱗癌的診斷和治療提供新的臨床策略。