張紅妤 孫 芳 肖 朋

1 新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院口腔科，新疆烏魯木齊市 830028； 2 新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院口腔科

髁突軟骨是骨化成骨的鑰匙，是形成髁狀突骨質(zhì)的先決條件，研究髁突軟骨在壓力作用下的凋亡變化有助于解釋髁突病變的機理。本課題擬研究髁突軟骨細胞在一定的壓力和時間范圍內(nèi)的凋亡情況，總結(jié)髁突軟骨細胞在一定壓力條件下的凋亡變化規(guī)律，分析臨床中常見的關(guān)節(jié)盤移位以及正畸、修復(fù)治療對髁突受力情況的影響，為臨床如何促進髁突合理受力和避免髁突不良受力提供一些啟示。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 磷酸酶抑制劑(碧云天)，RIPA裂解液(碧云天)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)，SDS上樣緩沖液(Amresco，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，30%丙烯酰胺(Amresco)，TG[Biosharp，西格瑪奧(上海)貿(mào)易有限公司]，蛋白marker(14～120kD，北京全氏金生物技術(shù)有限公司)，PVDF膜(0.45μM，Millipore)，兔抗GAPDH 37kD(杭州賢至生物有限公司)，兔抗FAS 48kD(Santa Cruz)，HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，ECL底物液(Thermo)，X光膠片(柯達)，顯影定影試劑盒(武漢巴菲爾生物)。

1.2 細胞來源及分組、處理 取大鼠髁突軟骨細胞第三代細胞[6]，首先按照加壓時間分為1h、2h、4h三組，然后每組內(nèi)按靜水壓力0kPa、6kPa、8kPa、10kPa、20kPa、30kPa隨機分成6組，共計18組，其中0kPa為對照組，其余為實驗組。分別按照相對應(yīng)的實驗壓力條件和時間條件對各組進行加壓處理，處理完畢后收集細胞備檢。

1.3 加壓設(shè)備及壓力值 參考Koyama Y、Kunii R、Xiao E等[7-9]的壓力值及加壓方法，自制充氣式加壓裝置。即向培養(yǎng)瓶內(nèi)注入空氣至壓力表指針達到指定壓強，立即移入培養(yǎng)孵箱并計時。

1.4 凋亡蛋白檢測 以Western Blot法檢測細胞FAS蛋白表達量。

1.4.1 制備蛋白樣品。先提取單層貼壁細胞總蛋白，10倍稀釋樣品蛋白，制定BSA標準蛋白濃度，用DG-3022A酶標儀測定OD568。再根據(jù)BSA標準品和對應(yīng)的OD值可計算出直線回歸方程，根據(jù)樣品蛋白OD值，通過回歸方程測定蛋白樣品的濃度。最后沸水浴10min使樣品蛋白變性。

1.4.2 電泳及電轉(zhuǎn)移。先配制電泳膠，再將樣品蛋白和蛋白marker滴入上樣孔，各樣品總蛋白量為40μg，行電泳分離。最后以FAS-200mA 120min的轉(zhuǎn)膜條件開始電轉(zhuǎn)移。

1.4.3 免疫印跡顯色：ECL顯色系統(tǒng)。先將PVDF膜置于TBST溶液中，室溫搖床封閉2h。用封閉液按 1∶200稀釋一抗，浸泡PVDF膜過夜后洗去多余一抗。用封閉液按1∶50 000稀釋相應(yīng)的HRP標記羊抗兔二抗，浸泡PVDF膜2h后洗去多余二抗。滴入ECL試劑使PVDF膜顯色，X 光膠片壓片后常規(guī)沖洗膠片。

1.4.4 結(jié)果與分析。晾干膠片并掃描，用BandScan行灰度值分析，以抗大鼠GAPDH作為內(nèi)參，F(xiàn)AS/GAPDH作為蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組FAS蛋白表達量 各組FAS蛋白表達量見表1。在同一時間分組內(nèi)，隨著靜水壓力的增加，F(xiàn)AS蛋白表達量呈先降低后上升的趨勢；當靜水壓力為6kPa、8kPa、10kPa，實驗組的FAS蛋白表達量均低于0kPa，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；當靜水壓力為30kPa時，不同時間分組的FAS蛋白量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但在20kPa/1h、20kPa/2h分組時，實驗組的蛋白量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。蛋白表達條帶圖見圖1。

表1 不同時間不同壓力值下MCCs的FAS/GAPDH蛋白表達情況比較

2.2 不同時間條件下細胞凋亡蛋白隨壓力變化情況 當壓力在0～20kPa時，細胞凋亡水平基本呈先降低后逐漸回升至原始水平，細胞在此壓力范圍內(nèi)表現(xiàn)為抑制凋亡，當壓力在20～30kPa時，細胞凋亡程度則呈現(xiàn)為隨壓力和時間增加逐漸增長，表現(xiàn)為促進凋亡。見圖2。

2.3 不同壓力條件下細胞凋亡蛋白隨時間變化情況 在受壓時間1～2h內(nèi)，壓力值為10kPa時對細胞凋亡的抑制程度最大，在受壓時間2～4h內(nèi)，在30kPa、4h條件下促細胞凋亡作用最大。見圖3。

3 討論

適當?shù)牧W(xué)刺激是髁狀突終生保持改建能力的生物學(xué)基礎(chǔ)，對髁突軟骨細胞的生物學(xué)反應(yīng)意義十分重大。適度的力學(xué)刺激對保持正常的解剖結(jié)構(gòu)、生理功能是必需的[10]。正常狀態(tài)下的髁突軟骨能夠接受適當強度的壓力，假若壓力過大或時間過長，則可損傷關(guān)節(jié)軟骨，受損程度與壓力的強度、方式及受壓時間有關(guān)[11]。顳下頜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)功能復(fù)雜，在臨床中關(guān)節(jié)自身病變及正畸、修復(fù)治療等都會對顳下頜關(guān)節(jié)髁突的受力造成影響。

關(guān)節(jié)盤移位是TMD中一種常見的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂性疾病，其臨床患病率較高[12]。鄒冰爽[13]通過對比觀察面部不對稱患者雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)盤情況發(fā)現(xiàn)，有髁突發(fā)育障礙的偏斜側(cè)關(guān)節(jié)盤形態(tài)和功能存在不同程度變化，前下移位者明顯偏多，顯示髁突發(fā)育不良的原因與關(guān)節(jié)盤移位有一定關(guān)系。另有學(xué)者[14-16]則報道不可復(fù)性盤前移位能妨礙關(guān)節(jié)盤正常活動，使髁突前斜面受壓，破壞髁突骨質(zhì)。韓建輝等[17]認為不可復(fù)性關(guān)節(jié)盤前移位患者患病時間越長，開口度越大，出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)病可能性也越大。開口度越大，患者越用力張口，關(guān)節(jié)盤對髁突的壓力越大，髁突受壓更加嚴重。這一點也符合本研究總結(jié)的壓力作用下軟骨細胞凋亡的規(guī)律，即長時間較大壓力作用下，細胞凋亡會增加，不利于髁突骨質(zhì)改建。雖然目前沒有學(xué)者明確報道不可復(fù)性關(guān)節(jié)盤擠壓髁突的詳細壓力值，但推測這種擠壓產(chǎn)生的壓力值可能在20kPa以上。另外這種擠壓產(chǎn)生的壓力大小，可能會受到關(guān)節(jié)盤移位程度、移位方向、關(guān)節(jié)盤質(zhì)地及關(guān)節(jié)囊松弛狀態(tài)等諸多因素的影響，臨床檢測難度較大。這一點提示我們，在臨床中應(yīng)及早采取適當治療措施，避免髁突受長時間擠壓，尤其是在髁突表面軟骨細胞層明顯的生長發(fā)育階段。

牙齒重度磨耗是老年口腔問題中的一種常見病，存在牙齒重度磨耗的老年患者中有部分存在明顯的顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病癥狀，但在咬合重建后患者顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的臨床癥狀得到了明顯好轉(zhuǎn)[21]。牙齒重度磨耗后，髁突的位置發(fā)生了相應(yīng)的調(diào)整，髁突向后上移位，關(guān)節(jié)后上間隙均較小[22-23]?；颊叱霈F(xiàn)顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病癥狀的原因可能與髁突與其后上部位的軟組織相互擠壓有關(guān)，但目前未見牙齒重度磨耗與髁突骨質(zhì)破壞之間存在明顯相關(guān)性的報道。可能與老年人群中髁突表面以硬化皮質(zhì)骨為主，軟骨細胞少，壓力對骨質(zhì)影響較小有關(guān)。但髁突與其后上方軟組織之間的互相擠壓可能會引發(fā)炎癥或刺激雙板區(qū)感覺神經(jīng)引發(fā)一系列臨床癥狀。所以，從壓力對細胞凋亡影響的規(guī)律來看，對重度磨耗患者及時進行咬合重建的修復(fù)治療有利于髁突骨質(zhì)的健康。

深覆頜患者常有口腔不良習(xí)慣，例如緊咬牙、夜磨牙等，常導(dǎo)致顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)的骨質(zhì)改變。多數(shù)學(xué)者認為其原因與關(guān)節(jié)內(nèi)壓力有關(guān)，Mori等[24]研究表明長時間壓力作用下使顳下頜關(guān)節(jié)功能性過載，與關(guān)節(jié)退行性病變的發(fā)生有關(guān)。因此，對于深覆頜患者，破除口腔不良習(xí)慣對于顳下頜關(guān)節(jié)的保護至關(guān)重要。

FAS途徑是軟骨細胞凋亡的途徑之一，F(xiàn)AS基因也是公認的凋亡活化基因，在凋亡活化階段中發(fā)揮著重要作用，F(xiàn)AS及配體在髁突軟骨細胞中的高表達，從而使FAS表達量成為檢測細胞凋亡的指標之一[25]。本研究以檢測FAS蛋白表達來反映軟骨細胞凋亡的變化情況，雖然可能不能完全說明細胞凋亡的真實情況，具有一定片面性，但也足以說明一定問題。

綜上所述，本研究所揭示的一定范圍壓力條件下細胞凋亡變化的規(guī)律可以較好地解釋以上臨床中常見的髁突受力改變而引起的骨質(zhì)變化問題，為顳下頜關(guān)節(jié)髁突病變的機制提供了一些理論支持，為臨床中如何從髁突受力因素避免髁突發(fā)生病變提供了一些啟示。