蔣 擎 陳曉超 田康勇 謝超春 劉騰鴻 林燕云 游純秋

1 福建省福州市中醫(yī)院骨科 350001； 2 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院； 3 山東威高骨科材料股份有限公司

骨折作為臨床工作中的常見病、多發(fā)病，如何加速其愈合進(jìn)程，提高其愈合質(zhì)量，成為骨科醫(yī)師一直密切關(guān)注的重大課題之一[1]。近年來隨著研究的不斷深入，研究人員從臨床觀察及實驗室研究[2-5]均證實藥物外治法對骨折愈合有明顯優(yōu)勢，與此同時如何提高外用藥透皮吸收效率，進(jìn)而提高外用藥在骨折病灶局部的有效濃度是目前研究熱點(diǎn)。前期研究[6]證實藥物在融合有Tat短肽后可增強(qiáng)透皮吸收效果，故本研究擬采用三七的主要有效成分三七總皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)結(jié)合細(xì)胞穿透肽Tat(47-57)進(jìn)行聯(lián)合外用給藥，嘗試提高PNS的透皮吸收效率，進(jìn)而使其在骨折病灶局部達(dá)到有效的治療濃度，觀察PNS在細(xì)胞穿透肽Tat的協(xié)助下是否能夠促進(jìn)骨折病灶部位的加速愈合。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)藥品：動物實驗所需的各種外用霜膏劑委托寧波睿晅生物科技有限公司生產(chǎn)，三七總皂苷(純度80%)購自西安百川生物科技有限公司，短肽Tat(47-57)上海淘普生物科技有限公司合成，其他各種化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。(2)實驗動物：SD雄性大鼠40只，體重在300～340g之間。

1.2 方法

1.2.1 骨折SD雄性大鼠模型的建立：將40只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后進(jìn)行造模。具體方法如下：將大鼠以仰臥位固定于操作臺上，右下肢小腿備皮、碘伏消毒后，用血管鉗鈍性折斷大鼠右下肢脛骨，不做固定。

1.2.2 分組及用藥：實驗動物成功建模后，將大鼠隨機(jī)分為四組：空白對照組、外用三七總皂苷組(PNS外用組)、外用三七總皂苷和細(xì)胞穿透肽聯(lián)合組(Tat-PNS外用組)、口服三七總皂苷組(PNS口服組)，每組10只。根據(jù)不同分組進(jìn)行給藥：(1)Tat-PNS外用組：Tat-PNS外用(其中PNS濃度為1%W/V，Tat濃度為0.05%W/V)，經(jīng)皮給藥量3g/次，2次/d。(2)PNS外用組：PNS外用(其中PNS濃度為1% W/V)，經(jīng)皮給藥量3g/次，2次/d，給藥方式與Tat-PNS外用組一致。(3)PNS口服組：PNS口服(其中PNS濃度0.1g，純度80%)，0.10g/次，2次/d。(4)空白對照組不予上述藥物治療。給藥為期14d，實驗期間各組動物均予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)。

1.3 分析實驗方法

1.3.1 皮膚組織抗氧化能力SOD水平測定。稱取約0.10g右下肢小腿組織，加入1ml提取液，進(jìn)行冰浴勻漿；轉(zhuǎn)速8 000r/min、4℃離心10min，取上清，置冰上待測。SOD酶活力采用鄰苯三酚自氧化方法測定，具體操作按照南京建成生物工程研究所SOD試劑盒操作手冊進(jìn)行實驗。

1.3.2 病灶組織取樣。于手術(shù)后2周以斷頸法處死大鼠，自膝關(guān)節(jié)處將雙小腿離斷，去除小腿皮膚及軟組織備用，將脛腓骨聯(lián)臺取出，用10%福爾馬林溶液固定1周，分離出脛骨，以原骨折處和缺損處為中心取脛骨段10mm，做組織學(xué)切片(縱切)，以備免疫組化染色觀察。

1.3.3 實驗動物骨折處骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)免疫組織化學(xué)染色。(1)石蠟切片制作：將實驗動物骨折處新鮮組織用固定液固定24h以上。將組織從固定液取出在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)刀將目的部位組織修平整，將修切好的組織和對應(yīng)的標(biāo)簽放于脫水盒內(nèi)。將脫水盒放進(jìn)脫水機(jī)內(nèi)依次梯度酒精進(jìn)行脫水，隨后進(jìn)行石蠟包埋。將浸好蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，待蠟?zāi)讨皩⒔M織從脫水盒內(nèi)取出按照包埋面的要求放入包埋框并貼上對應(yīng)的標(biāo)簽。于-20°凍臺冷卻，蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出并修整蠟塊。將修整好的蠟塊，放入-20℃凍臺冷卻，再將冷卻的蠟塊置于石蠟切片機(jī)切片，厚4μm。切片漂浮于攤片機(jī)40℃溫水上將組織展平，載玻片將組織撈起，60℃烘箱內(nèi)烤片。水烤干、蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩?2)BMP-2免疫組化測定：切片放入切片架內(nèi)，60℃烘箱內(nèi)烤60～90min。經(jīng)過脫蠟處理后，進(jìn)行抗原修復(fù)步驟。組化盒內(nèi)加入2/3的1×檸檬酸溶液，并提前放入微波爐加熱至沸騰。切片放入組化盒蓋上蓋子小火微沸1min，取出室溫靜置5min，微沸4次后，蓋上濕布冷卻至室溫。用PBS清洗輕輕震蕩數(shù)次后，于室溫放置8min。添加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10min。隨后滴加5%BSA，室溫下封閉孵育20min后，甩去并擦干多余液體。滴加一抗(提前用5%BSA稀釋)，置于濕盒內(nèi)4℃冰箱過夜，對照組陽性/陰性滴加BSA孵育過夜。12h后，37℃水浴鍋或烘箱內(nèi)復(fù)溫30min，PBS沖洗3次，2min/次。隨后進(jìn)行二抗孵育：滴加HRP酶標(biāo)二抗(這是生物素標(biāo)記的二抗，所以需要第三步，PBS稀釋)，37℃孵育30min，PBS洗5次，5min/次。滴加試劑SABC[辣根過氧化物酶標(biāo)記HRP-Streptavidin,1∶(200～400)PBS稀釋]，37℃孵育30min，PBS洗4次，5min/次。甩去PBS緩沖液，滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察直到樣本組織被染成深褐色(且陰性樣本不出現(xiàn)顏色)，立即用ddH2O沖洗終止染色，并記錄染色時間。染色后甩干表面ddH2O，滴加蘇木素，染色3min，自來水洗去蘇木素；分化液(G1039)分化約3s，自來水洗；返藍(lán)液(G1040)返藍(lán)約3s，至出現(xiàn)較藍(lán)顏色為止，自來水洗。用梯度酒精浸泡脫水，自然風(fēng)干或反面吹干。最后將切片水平放置于切片版上，在樣本中間滴加中性樹脂進(jìn)行封片，傾斜蓋上蓋玻片，排出氣泡。鏡檢拍照分析BMP-2在切片中的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 不同給藥組對實驗動物骨折處皮膚組織抗氧化能力SOD水平的影響 四組SOD活性比較：Tat-PNS外用組(40.23±11.29)U/mg、PNS口服組(30.36±7.32)U/mg、PNS外用組(28.23±6.34)U/mg明顯高于空白對照組(19.23±2.39)U/mg(P<0.05)，其中Tat-PNS外用組、PNS口服組SOD活性均高于PNS外用組(P<0.05)，與PNS口服組相比，Tat-PNS外用組SOD活性明顯提高(P<0.01)。

2.2 不同給藥組對實驗動物骨折處骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2表達(dá)水平的影響 骨折后第2周，各給藥組骨折處組織切片BMP-2表達(dá)水平結(jié)果顯示，空白對照組BMP-2的表達(dá)水平最低，基本未見陽性細(xì)胞。PNS口服組和普通PNS外用組中可見少量的陽性細(xì)胞，表明普通外用給藥和口服給藥可以促進(jìn)并上調(diào)BMP-2在病灶組織中的表達(dá)。而著色最深的實驗組是Tat-PNS外用組，骨痂組織中成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和類骨質(zhì)中的骨細(xì)胞胞漿中，均可見明顯的BMP-2表達(dá)的棕黃色產(chǎn)物。具體見圖1。

3 討論

在祖國醫(yī)學(xué)中，三七具有止血、化瘀、止痛的藥理作用，很早便被人們廣泛應(yīng)用于各種骨傷疾病的治療中，具有良好的臨床功效，其中，PNS是三七的主要有效成分，其使用方法主要是口服，但藥物口服，無法避免肝臟的首過效應(yīng)，導(dǎo)致藥物的生物利用度降低，同時還存在胃腸蠕動及胃腸酸堿的減效作用。但經(jīng)皮給藥方式亦存在技術(shù)難點(diǎn)——如何保證有效分子的高效透皮吸收，在盡可能保障中藥透皮制劑吸收速率提高的同時，最大限度降低透皮制劑皮膚刺激性。近年來其發(fā)展迅速，再與新型經(jīng)皮給藥劑型相結(jié)合，聯(lián)合促進(jìn)中藥經(jīng)皮吸收。

近年來細(xì)胞穿透肽(Cell penetrating peptide，CPP)的主動跨膜遞送作用的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用研究為傳統(tǒng)藥物的透皮吸收瓶頸問題帶來了希望。CPP是一類具有跨膜遞送生物大分子進(jìn)入細(xì)胞能力的短肽，被廣泛認(rèn)為是最有希望和應(yīng)用前景的經(jīng)皮給藥遞送方式[7]。細(xì)胞穿透肽能夠輸送不同種類的生物分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；某些短肽甚至具備突破血腦屏障、血睪屏障和胎盤屏障的能力[8]。自1988年首次發(fā)現(xiàn)來源于人免疫缺陷病毒中的HIV-Tat蛋白具有主動跨膜功能以來[9]，利用細(xì)胞穿透肽作為細(xì)胞內(nèi)藥物遞送載體，已經(jīng)成功將不同物理尺寸大小的生物分子高效遞送進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從寡核苷酸、DNA、反義RNA，到短肽、蛋白質(zhì)，甚至是磁性納米顆粒和微米級的脂質(zhì)體[10]。其中Tat(47-57)是細(xì)胞穿透肽中研究時間最長、研究最透徹、應(yīng)用范圍最廣的一種細(xì)胞穿透肽[11]。鑒于Tat對生物大分子的高效跨膜遞送作用，以及蛋白質(zhì)等生物大分子非常難以進(jìn)入皮膚，即使通過離子導(dǎo)入、超聲波引導(dǎo)等方法也只能少部分進(jìn)入的現(xiàn)實問題，一些學(xué)者研究了Tat在藥物的透皮吸收方面的應(yīng)用，這其中包括Tat在抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物的透皮吸收方面的應(yīng)用研究。例如，Mi Z等報道了一個關(guān)節(jié)滑膜特異性的Tat及其透皮遞送細(xì)胞凋亡試劑進(jìn)入滑膜，從而治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的滑膜組織增生[12]。這些結(jié)果提示我們，Tat的跨膜遞送作用有望促使局部涂抹的SOD分子到達(dá)關(guān)節(jié)病灶組織。總之，Tat有望解決用于治療骨性疾病的藥物透皮吸收難題，最大化促進(jìn)藥物分子有效到達(dá)關(guān)節(jié)病灶組織，并促使藥物分子跨膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。

本研究動物實驗結(jié)果顯示：細(xì)胞穿透肽Tat可以明顯提高目標(biāo)藥物PNS的透皮吸收效率，從而導(dǎo)致PNS在骨折病灶部位的高濃度富集；Tat短肽促進(jìn)PNS在病灶組織附近的高度富集，進(jìn)而明顯增加病灶局部的皮膚上抗氧化活性，皮膚組織SOD水平得到顯著提升(P<0.05)，Tat-PNS外用組其病灶部位藥物吸收效果明顯優(yōu)于普通外用PNS及空白對照組，而且能夠與PNS口服組基本持平；此BMP-2可通過上調(diào)破骨細(xì)胞的數(shù)量及活性，從而促進(jìn)板層骨的提前形成，并誘導(dǎo)髓腔再通，而新生連接骨皮髓腔的再生被視為骨折愈合的標(biāo)志，由此有研究人員[13-14]提出BMP-2的濃度可一定程度顯示骨折病灶的愈合程度，二者具有正相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示Tat-PNS外用組中BMP-2陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯高于普通外用PNS及空白對照組，并最終在實驗動物模型中表現(xiàn)出比普通PNS外用組和PNS口服組更好的骨折修復(fù)效果。

總之，本研究中各項實驗數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞穿透肽Tat可以改善三七總皂苷PNS透皮吸收能力，大幅度改善PNS經(jīng)皮給藥的生物利用度，本研究為三七總皂苷大面積的臨床實驗及更深入的科學(xué)研究提供相應(yīng)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。