張慧珍

摘 要：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一種人畜共患病的病原菌，是一種常見的土壤細(xì)菌，能引起嚴(yán)重食物中毒，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌廣泛存在于自然界中，食品中存在的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌對(duì)人類的安全具有一定的威脅，該菌在

4 ℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品中威脅人類健康的主要病原菌之一。本文通過(guò)采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.30—2016）對(duì)大量肉、奶、蛋和水產(chǎn)品等產(chǎn)品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)，總結(jié)了一些食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，主要從試劑準(zhǔn)備、增菌、劃線分離及生化鑒定等方面闡述了對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特檢測(cè)的一些理解，以期為食品檢測(cè)工作中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)提供部分參考。

關(guān)鍵詞：食品;單核細(xì)胞增生李斯特氏菌;國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法

Discussion on Detection Method of Listeria monocytogenes in Food

ZHANG Huizhen

（Pony Testing Group International Co.， Ltd.， Beijing 100194， China）

Abstract： Listeria monocytogenes is a zoonotic pathogen. It is a common soil bacterium that can cause serious food poisoning. After infection， it is mainly manifested in sepsis， meningitis and mononucleosis. It exists widely exists in nature. Listeria monocytogenes in food is dangerous to human safety. The bacteria can still grow and reproduce in the environment of 4 ℃， and it is one of the main pathogenic bacteria that threaten human health in refrigerated food. By using the national standard detection method GB 4789.30—2016 to detect Listeria monocytogenes in a large number of meat， milk， eggs and aquatic products， this paper summarizes the detection experience of Listeria monocytogenes in some foods， and expounds some understandings of Listeria monocytogenes detection mainly from the aspects of reagent preparation， enrichment， lineation separation and biochemical identification， in order to provide some reference for the detection of Listeria monocytogenes in food testing.

Keywords： food; Listeria monocytogenes; national standard detection method

李斯特氏菌屬隸屬革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中厚壁菌門，李斯特氏菌屬可劃分為6個(gè)菌種，即單核增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、英諾克李斯特氏菌（L. innocua）、斯氏李斯特氏菌（L. seeligeri）、威爾斯特氏菌（L. welshimeri）、伊氏李斯特菌（L. ivanovii）和格氏李斯特菌（L. grayi）[1]。在這6個(gè)菌種中只有單核增生李斯特和伊氏李斯特氏菌可以引起動(dòng)物發(fā)病，其中通常只有單核增生李斯特氏菌和人類的李斯特氏菌癥相關(guān)。單核細(xì)胞增生李斯特菌是一種人畜共患病的病原菌，能引起人畜的李氏桿菌病，人畜感染后主要表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥和單細(xì)胞增多，尤以妊娠期婦女，新生兒及免疫功能低下的病人更易感染。因此，李斯特氏菌中最具檢測(cè)意義的是單核增生李斯特氏菌。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌廣泛分布于自然界，如土壤、屠宰場(chǎng)、食品生產(chǎn)加工器具和多種食品中，動(dòng)物或人體也帶有此菌。食品中存在的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌對(duì)人類的身體健康極具危害，該菌在

4 ℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。

當(dāng)前對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)檢測(cè)方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）[2]、以聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)等[3-4]。隨著科技不斷發(fā)展，針對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)技術(shù)也越來(lái)越多，新興的檢測(cè)方法具有檢測(cè)周期短、成本高等特點(diǎn)，而大多數(shù)食品生產(chǎn)、食品流通企業(yè)仍會(huì)選擇低成本的傳統(tǒng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。想要得到精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果，新興的檢測(cè)方法依賴于試驗(yàn)設(shè)備，而傳統(tǒng)的檢測(cè)方法更依賴于人員的經(jīng)驗(yàn)，因此采用傳統(tǒng)的方法檢測(cè)單增李斯特氏菌對(duì)試驗(yàn)員提出了更高的要求。

1 目的和意義

本文主要從試劑準(zhǔn)備、增菌、劃線分離及生化鑒定等方面闡述了對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特檢測(cè)的一些理解，以期為檢測(cè)人員依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.30—2016）進(jìn)行食品中單增李斯特氏菌檢測(cè)提供參考，減少人為因素造成的漏判或漏檢。

2 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法GB 4789.30—2016的探討

食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)需進(jìn)行増菌、分離、初篩和鑒定4個(gè)連續(xù)過(guò)程。

2.1 增菌

食品經(jīng)常同時(shí)受到多種致病菌污染，為提高對(duì)應(yīng)致病菌的檢出率，樣品檢測(cè)前需先進(jìn)行抑菌和增菌過(guò)程。例如，將檢驗(yàn)樣品25 g（mL）加入到含有

225 mL LB1增菌液中，均質(zhì)，（30±1）℃培養(yǎng)24 h，移取0.1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL LB2增菌液內(nèi)，于（30±1）℃培養(yǎng)18～24 h。此過(guò)程中，增菌液中的萘啶酮酸和吖啶黃通過(guò)抑制細(xì)菌脫氧核苷酸的合成機(jī)理對(duì)革蘭氏陰性菌和鏈球菌起到了抑制作用，同時(shí)由于單增李斯特具有耐冷特性，通過(guò)低溫培養(yǎng)使其快速繁殖生長(zhǎng)，便于檢出[5]。在進(jìn)行增菌操作步驟時(shí)，應(yīng)該注意以下問(wèn)題。

（1）在配制LB1、LB2基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)先將李氏增菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基按照配制比例加熱溶解，再進(jìn)行高溫高壓滅菌，以防培養(yǎng)基受熱不均勻，破壞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分。

（2）配制好的LB1、LB2使用前再按要求量加入萘啶酮酸和吖啶黃素。萘啶酮酸對(duì)光較敏感，因此要注意避光保存且LB1、LB2最好現(xiàn)用現(xiàn)添加。吖啶黃素有一定的致癌性，在使用過(guò)程中要注意打開安瓿瓶時(shí)動(dòng)作要輕柔，必要時(shí)可以用砂輪多摩擦幾次瓶頸處，然后再輕輕掰開，以免液體濺出接觸到試驗(yàn)人員。

（3）從培養(yǎng)后的LB1中移取0.1 mL轉(zhuǎn)接到10 mL LB2中，因轉(zhuǎn)接量較小、增菌液不均等原因，容易造成漏檢，應(yīng)先將LB1充分混合均勻。在混勻過(guò)程中，避免產(chǎn)生大量對(duì)人體有害的氣溶膠，通過(guò)眼鼻黏膜或者吸入方式感染試驗(yàn)人員或污染環(huán)境，在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格注意無(wú)菌操作、動(dòng)作輕柔及生物安全，并做好人員防護(hù)。

2.2 分離

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，為從增菌液中分離出獨(dú)立的目標(biāo)菌，取LB2二次增菌液劃線接種于PALCAM瓊脂平板和李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上，于（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。典型菌落在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。典型菌落在柯瑪嘉顯示培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍(lán)色菌落，有白色暈環(huán)。

李斯特顯色培養(yǎng)基增補(bǔ)劑的添加及注意事項(xiàng)有以下幾點(diǎn)。①增補(bǔ)劑需在基礎(chǔ)培養(yǎng)基滅菌后，倒平皿前根據(jù)每次基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制量添加，在添加前無(wú)滅菌過(guò)程，所以在稱取及配制過(guò)程中一定要非常注意無(wú)菌操作，以免造成增補(bǔ)劑的污染，致使培養(yǎng)基的大量浪費(fèi)，稱取后嚴(yán)格按照無(wú)菌要求密封增補(bǔ)劑以便后期使用。②單增李斯特和其他的李斯特菌有相似的生長(zhǎng)特性，它們?cè)趥鹘y(tǒng)的培養(yǎng)基上不易被區(qū)分，而李斯特顯色培養(yǎng)基上可以通過(guò)白色暈環(huán)來(lái)區(qū)分，因此白色暈環(huán)對(duì)于區(qū)分單增李斯特和其他李斯特菌具有指導(dǎo)意義。但有時(shí)單增李斯特在李顯培養(yǎng)基上無(wú)白色暈環(huán)，通過(guò)陽(yáng)性菌對(duì)照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)如果增補(bǔ)劑不夠均勻或配制好的平皿保存不當(dāng)均可能出現(xiàn)無(wú)白色暈環(huán)問(wèn)題。所以增補(bǔ)劑在配制過(guò)程中一定要攪拌均勻，使其完全溶解，最終成為奶油狀的均質(zhì)溶液，避免在顯色培養(yǎng)基中出現(xiàn)很多絮狀凝塊，造成應(yīng)有的白色暈環(huán)不明顯，甚至不出現(xiàn)，故在試驗(yàn)過(guò)程中采用陽(yáng)性對(duì)照菌株驗(yàn)證培養(yǎng)基尤為

重要。

2.3 初篩

自選擇性瓊脂平板上分別挑取5個(gè)以上典型或可疑菌落，分別接種在木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h;同時(shí)在TSA-YE平板上劃線純化，于（30±1）℃培養(yǎng)24～48 h。選擇木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。關(guān)于初篩過(guò)程選菌問(wèn)題有以下幾點(diǎn)建議。

（1）從不同角度觀察平皿上的菌落。因GB 4789.30—

2016中規(guī)定選擇兩種選擇性培養(yǎng)基，在大量的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，李斯特顯色培養(yǎng)基的區(qū)分度很高，首先選擇在李顯上呈現(xiàn)藍(lán)色菌落，帶白色暈圈的菌做初篩，這樣可減少部分試驗(yàn)室工作。在選菌時(shí)，一定注意要從不同角度觀察平皿上的菌落，避免因?yàn)楣饩€角度或者菌落生長(zhǎng)狀態(tài)問(wèn)題，而未發(fā)現(xiàn)帶有白色暈圈的菌落。同時(shí)李顯的培養(yǎng)時(shí)間也很重要，有些菌株在培養(yǎng)24 h時(shí)呈現(xiàn)藍(lán)色菌落，但無(wú)白色暈圈，隨著培養(yǎng)時(shí)間的加長(zhǎng)，白色暈圈才會(huì)出現(xiàn)，48 h時(shí)會(huì)很明顯。因此，李斯特顯色培養(yǎng)基需培養(yǎng)24～48 h。若培養(yǎng)48 h后李顯培養(yǎng)基上無(wú)帶暈圈菌落，則再?gòu)腜ALCAM培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。

（2）選擇較大菌落。初次篩選從一個(gè)菌落上既接生化，又進(jìn)行劃線純化確實(shí)存在困難，初篩最好選擇較大菌落?？紤]到單增李斯特氏菌菌體較小，培養(yǎng)24～48 h后可達(dá)到1～2 mm，建議先將可疑菌落做平板劃線純化，然后再進(jìn)行生化鑒定。為節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，李顯培養(yǎng)基上的典型菌落可將純化平皿和其他鑒定試驗(yàn)一起進(jìn)行。

2.4 鑒定

在單增李斯特氏菌國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法中鑒定包括鏡檢、動(dòng)力試驗(yàn)、生化鑒定、溶血試驗(yàn)和協(xié)同溶血試驗(yàn)。這些鑒定方式在單增檢測(cè)中溶血試驗(yàn)和協(xié)調(diào)溶血試驗(yàn)既是關(guān)鍵試驗(yàn)也是難點(diǎn)。

（1）鏡檢、生化試驗(yàn)。一般無(wú)論是PALCAM還是李斯特顯色培養(yǎng)基出現(xiàn)可疑菌落，鏡檢時(shí)菌體大都符合李斯特菌特點(diǎn)，李斯特氏菌呈小的、類似球形的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，呈短鏈，在營(yíng)養(yǎng)不良培養(yǎng)基中可形成絲狀[6]。若在PALCAM或李斯特顯色培養(yǎng)基上未呈現(xiàn)可疑菌落，不能進(jìn)行初篩，一般可進(jìn)一步通過(guò)生化試驗(yàn)，如過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、MR-VP試驗(yàn)等，進(jìn)行排除。若菌落呈陽(yáng)性反應(yīng)，則為李斯特

氏菌。

（2）溶血試驗(yàn)。將羊血瓊脂平板底面劃分為20～25個(gè)小格，挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落刺種到血平板上，每格刺種一個(gè)菌落，并刺種陽(yáng)性對(duì)照菌（單增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌）和陰性對(duì)照菌（英諾克李斯特氏菌），穿刺時(shí)盡量接近底部，但不要觸到底面，同時(shí)避免瓊脂破裂，（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h，于明亮處觀察，單增李斯特氏菌呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的溶血圈，斯氏李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周圍產(chǎn)生弱的透明溶血圈，英諾克李斯特氏菌無(wú)溶血圈，伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的β-溶血區(qū)域。若結(jié)果不明顯，可置于

4 ℃冰箱24～48 h后再觀察。在實(shí)際工作中，由于單增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌產(chǎn)生的狹小的β溶血環(huán)很難觀察，經(jīng)大量穿刺不同厚度的血平板試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在瓊脂厚度1～1.5 mm的血平板上穿刺更有利于觀察溶血現(xiàn)象，且僅需培養(yǎng)24 h。通過(guò)調(diào)整血平板厚度，極大方便了試驗(yàn)員的觀察。血平板中培養(yǎng)基較薄，穿刺時(shí)會(huì)觸及底面，但這并不影響觀察狹小的β溶血，因?yàn)槿艟w無(wú)溶血，被接種針穿透處會(huì)被菌體填滿，狹小的β溶血會(huì)在原穿透位置四周部分溶血，而伊氏李斯特氏菌則會(huì)出現(xiàn)較大的溶血環(huán)。

（3）協(xié)同溶血試驗(yàn)。此試驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)是金黃色葡萄球菌的菌株類型，并不是所有金黃色葡萄球菌都能參與此試驗(yàn)。GB 4789.30—2016中明確規(guī)定所用金黃色葡萄球菌菌株編號(hào)為ATCC 25923，試驗(yàn)嘗試用ATCC 6538代替ATCC 25923，最終沒(méi)有出現(xiàn)協(xié)同溶血現(xiàn)象。另外，協(xié)同溶血試驗(yàn)所用菌株，最好選用相應(yīng)選擇性平板上的單個(gè)菌落，不要選擇新鮮培養(yǎng)的菌懸液，這樣既能保證菌株未被污染，也能防止菌懸液非肉眼可見的散落對(duì)試驗(yàn)現(xiàn)象的干擾。在此協(xié)同溶血試驗(yàn)中，對(duì)于血平板的薄厚要求不高，血平板略薄，培養(yǎng)不足24 h即可觀察到協(xié)同溶血

現(xiàn)象。

（4）溶血試驗(yàn)。溶血試驗(yàn)中血液一定要新鮮，尤其是單增李斯特菌的狹小的β溶血試驗(yàn)，如果血液不新鮮，觀察不到狹小的β溶血，容易造成誤判斷。建議血平板現(xiàn)配現(xiàn)用，并且最好不要放入電熱恒溫培養(yǎng)箱中除水汽，這樣對(duì)紅血球有一定的破壞性，致使后續(xù)溶血試驗(yàn)現(xiàn)象不能出現(xiàn)應(yīng)有的試驗(yàn)現(xiàn)象，觀察結(jié)果出現(xiàn)偏差，造成錯(cuò)判或者漏判。

（5）動(dòng)力試驗(yàn)。穿刺半固體或者SIM動(dòng)力培養(yǎng)基，培養(yǎng)基容器應(yīng)為小的玻璃試管，培養(yǎng)基的量應(yīng)在試管1/3處較合適，培養(yǎng)基試驗(yàn)前最好放入培養(yǎng)箱適當(dāng)去除水分，以免接種時(shí)有水汽，影響試驗(yàn)現(xiàn)象的觀察。穿刺時(shí)所用接種針要比較平直，穿刺過(guò)程中手部動(dòng)作要保持平穩(wěn)，不要出現(xiàn)抖動(dòng)，可以在穿刺時(shí)將接種針的接種桿貼著試管壁，以保證穿刺的

平穩(wěn)。

2.5 結(jié)果報(bào)告

結(jié)合生化試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告25 g（mL）樣品中檢出或未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。

3 結(jié)語(yǔ)

本文均是對(duì)GB 4789.30—2016檢測(cè)方法的一些理解和日常檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)的概述，旨在通過(guò)對(duì)每個(gè)檢測(cè)步驟關(guān)鍵點(diǎn)的分析，避免人為因素引起的錯(cuò)判和漏判。同時(shí)，希望能夠給試驗(yàn)人員提供比較詳細(xì)的檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，以便更高效地判斷試驗(yàn)現(xiàn)象與試驗(yàn)結(jié)果，保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

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