劉憲軍 王曉明 來創(chuàng)業(yè) 劉本發(fā) 王猛

摘 要：本文建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定滄州金絲小棗中多酚類物質(zhì)的方法。本方法線性相關(guān)系數(shù)r>0.998，檢出限為2.0 mg/kg，在50.0 mg/kg、200.0 mg/kg濃度添加水平下，回收率在83.4%～99.1%，RSD值在2.87%～4.27%。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、定性定量準(zhǔn)確，適用滄州金絲小棗中鄰苯二酚及間苯二酚的檢測。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法;滄州金絲小棗;多酚

Determination of Polyphenols in Cangzhou Golden Silk Jujube by High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

LIU Xianjun， WANG Xiaoming， LAI Chuangye， LIU Benfa， WANG Meng*

（Cangzhou Food and Drug Inspection Institute， Cangzhou 061001， China）

Abstract： In this paper， a high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method was established for the determination of polyphenols in Cangzhou golden silk jujube. The linear correlation coefficient of this method was r>0.998， and the detection limit was 2.0 mg/kg. At the concentration of 50.0 mg/kg and 200.0 mg/kg， the recovery rate was between 83.4% and 99.1%， and the RSD value was between 2.87% and 4.27%. The method has high sensitivity， good reproducibility， accurate qualitative and quantitative， and is suitable for the detection of catechol and resorcinol in Cangzhou golden silk jujube.

Keywords： high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; Cangzhou golden silk jujube; polyphenols

植物多酚又被稱作植物單寧，是由復(fù)雜的酚類在植物體內(nèi)經(jīng)過次生代謝所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是存在于糧食類食品（大麥粒、高粱米、大豆等）、水果蔬菜類食品（茶葉、大蔥、橘子等）或中草藥植物（陳皮、石榴皮等）中的一種酚類物質(zhì)，在植物體內(nèi)的含量較高[1-3]。目前，食品中多酚類化合物的測定方法有多種，高錳酸鉀滴定法、酒石酸亞鐵分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、原子吸收光譜法及高效液相色譜法[4-9]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

8030 Triple Quad液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司;ACQUITY BEH C18液相色譜柱（2.1 mm×

50 mm，1.7 μm），美國沃特世公司;高效液相色譜儀Waterse2695（二極管陣列檢測器），美國沃特世公司;電子分析天平，瑞士梅特勒公司;真空干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司;恒溫水浴振蕩器，常州國華儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA公司;超純制水機(jī)，美國默克密理博公司;酸度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;冷凍離心機(jī)，湖南湘智離心機(jī)儀器有限公司;甲醇、乙醇（色譜純），美國賽默飛世爾科技有限公司;鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度均大于98%），美國默克公司;間苯三酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度均大于98%），美國默克公司;其他試驗檢測用試劑均為分析純，天津科密歐有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

將滄州金絲小棗用水清洗后，去核、切片，在真空干燥箱中真空干燥（70 ℃，95 kPa），粉碎機(jī)粉碎，過60目篩。

準(zhǔn)確稱取經(jīng)粉碎后的棗粉約2.0 g（精確至1 mg）樣品放于250 mL的帶塞錐形瓶中，用量筒加入40%乙醇溶液40 mL，在恒溫水浴振蕩器中60 ℃恒溫水浴振搖60 min，反復(fù)振蕩浸提兩次，合并兩次的提取液，在60 ℃溫度下水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少于5 mL，再用10 mL水溶解殘渣。冷卻至室溫，倒入離心管中，然后放入離心機(jī)內(nèi)，在離心溫度為4 ℃的條件下，10 000 r/min離心5 min，然后用針管取上清液，將上清液過0.2 μm水系微孔濾膜，得試樣液，待凈化。

1.2.2 聚酰胺粉凈化

將1.2.1得到的試樣液在聚酰胺柱上樣，控制流速不超過2 mL/min，用75%乙醇溶液淋洗，收集洗脫液。洗脫液60 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL。冷卻至室溫，然后于離心機(jī)上4 ℃下10 000 r/min離心

5 min，并將上清液過0.2 μm水系微孔濾膜，進(jìn)行液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜法分析。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）;樣品的進(jìn)樣量：5 μL;柱溫箱溫度設(shè)定：

30 ℃;二極管陣列檢測器設(shè)置：檢測波長278 nm;流動相的設(shè)定：甲醇+含0.1%甲酸的10 mmol乙酸銨水溶液（10∶90，V/V）;柱流速設(shè)定：0.3 mL/min。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源;電離模式：負(fù)離子模式;干燥氣流速：N2，12 L/min;錐孔電壓：40 V;碰撞能量：30eV。

1.2.5 標(biāo)液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：稱取100 mg標(biāo)準(zhǔn)品，用20%

乙醇溶液定容至100 mL。標(biāo)準(zhǔn)使用液：用20%乙醇溶液稀釋至1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L及200.0 mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 滄州金絲小棗中多酚類物質(zhì)聚酰胺層析條件的優(yōu)化

對不同濃度甲醇淋洗液（35%、55%、70%、90%）洗脫得到的多酚提取液進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果分別為0.21 mg/g、1.25 mg/g、14.6 mg/g和0.79 mg/g，多酚的得率在70%甲醇淋洗條件下最高，均可達(dá)到80%以上。因此，70%甲醇為聚酰胺柱層析的最佳淋洗條件。

2.2 高效液相色譜條件的選擇及優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

本試驗采用在樣品中加標(biāo)的方式來選擇不同規(guī)格的液相色譜柱（苯基液相色譜柱、BEH C18液相色譜柱、C8液相色譜柱），分別做3次平行試驗。結(jié)果表明，苯基液相色譜柱對2種化合物不能完全分離，C8液相色譜柱峰型不好，BEH C18液相色譜柱柱則可達(dá)到基線全部分離，分離度明顯優(yōu)于其他兩種色譜柱（見圖1、圖2、圖3），本研究最終選擇BEH C18柱為分析柱。

2.2.2 流動相的選擇

經(jīng)比較，考察了流動相中甲醇濃度（5%、10%）對提取物中多酚類物質(zhì)的保留值和分離度的影響。由圖4、圖5可知，流動相在10%的甲醇濃度的條件下，使保留時間較短，峰形更尖銳對稱，分離較好。

2.2.3 進(jìn)樣量的選擇

本試驗分別對儀器（1 μL、2 μL、3 μL、4 μL及5 μL）不同的進(jìn)樣體積進(jìn)行了考察。試驗的結(jié)果顯示隨著儀器的進(jìn)樣體積的增加，檢出限會降低，響應(yīng)值也會相應(yīng)的增加，但是過大的進(jìn)樣體積也會對色譜柱有影響，有可能會超過色譜柱的柱容量，特別是會加快色譜柱的老化報廢，綜合以上原因選擇

2 μL的進(jìn)樣體積，滿足檢出限要求的同時也能有效地保護(hù)色譜柱。

2.2.4 柱溫的比較優(yōu)化

在相同的試驗條件下，對不同的柱溫（20 ℃、30 ℃、40 ℃及50 ℃）進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同柱溫箱溫度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃）各種條件下能滿足峰分離，本著節(jié)能環(huán)保的理念，選擇較常溫相近的溫度30 ℃作為柱溫箱溫度。

2.2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制濃度為1.0 μg/mL的鄰二苯酚、間苯三酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行母離子掃描，確定電離方式和分子離子峰，在分別獲得分子離子峰后，自動優(yōu)化錐孔電壓。經(jīng)試驗在負(fù)離子模式下鄰苯二酚母離子為m/z109，[C6H6O2-H]-豐度最高，間苯三酚掃描的母離子為m/z125，[C6H6O3-H-H2O]-豐度最高，具體內(nèi)容如表1所示。

2.2.6 回歸方程及檢出限

用標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制鄰苯二酚、間苯三酚濃度分別為1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L及200.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在已確定的色譜條件下進(jìn)行測定，峰面積（Y）對濃度（X）進(jìn)行線性回歸，由表2可知，在1.0～200.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r也均大于0.998，以3倍信噪比（S/N）計算方法的檢出限為2.0 mg/kg。

2.2.7 方法的回收率和精密度

通過向樣品加標(biāo)的方式做回收率和精密度試驗，分別向樣品中添加濃度50.0 mg/kg和200.0 mg/kg兩個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液后，按上述的方法進(jìn)行前處理和上機(jī)測定，進(jìn)行7次平行試驗。在表3中可見，加標(biāo)回收率在83.4%～99.1%，RSD在2.87%～4.27%，說明選定的方法滿足檢測要求。

3 結(jié)論

采用聚酰胺層析柱凈化，經(jīng)C18柱分離后，在278 nm下對鄰苯二酚及間苯三酚進(jìn)行測定，同時串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行確證。方法線性相關(guān)系數(shù)r>0.998，檢出限為2.0 mg/kg，在50.0 mg/kg、200.0 mg/kg濃度添加水平下，回收率在83.4%～99.1%，RSD在2.87%～4.27%。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、定性定量準(zhǔn)確，適用滄州金絲小棗中鄰苯二酚及間苯二酚的液相色譜法定量，質(zhì)譜法輔助定性。

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