張賽賽, 唐細(xì)蘭, 洪滿珠, 李東豪

暨南大學(xué)附屬?gòu)V州愛(ài)爾眼科醫(yī)院綜合科(廣東廣州 510400)

春季角結(jié)膜炎(vernal keratoconjunctivitis, VKC)屬于過(guò)敏性結(jié)膜炎的一類，是Ⅰ型及Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)共同參與的眼表炎癥，與季節(jié)性相關(guān)，常反復(fù)發(fā)作，以瞼結(jié)膜的乳頭增生和(或)角膜炎的膠凍樣增生為主，常累及角膜[1-4]。過(guò)敏性眼病可以和干眼同時(shí)存在[5-7]，并相互影響[8-9]。此外，VKC患者常伴有角膜損害[10-11]。在臨床中VKC的治療主要集中在解除癥狀，對(duì)VKC引起干眼和角膜改變常常沒(méi)有足夠重視。有文獻(xiàn)報(bào)道，VKC的治療需要同時(shí)考慮干眼的診斷和治療[12-13]，這對(duì)臨床可能存在潛在的指導(dǎo)意義，還需要進(jìn)一步的研究。本研究參照2017年 DEWS Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)[14]，利用非侵入性眼表分析儀和活體共聚焦顯微鏡(in vivo confocal microscopy, IVCM)評(píng)估VKC患者的淚膜和角膜形態(tài)學(xué)變化，為闡明VKC的角膜病理變化及VKC與干眼的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例組 選取2020年12月至2021年6月在暨南大學(xué)附屬?gòu)V州愛(ài)爾眼科醫(yī)院符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的VKC患者21例，所有患者為雙眼受累。其中男13例，女8例；年齡12～36歲，平均(13.20±8.30)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《我國(guó)過(guò)敏性結(jié)膜炎診斷和治療專家共識(shí)(2018年)》診斷為雙眼春季角結(jié)膜炎。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有其他眼表疾??；(2)患有其他可能會(huì)影響淚液分泌的系統(tǒng)性疾病者(如Graves病、干燥綜合征等)；(3)近半年內(nèi)接受眼部手術(shù)操作者；(4)近半年內(nèi)有眼外傷病史者；(5)近一個(gè)月佩戴角膜接觸鏡者；(6)全身使用免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素者。

1.1.2 對(duì)照組 同期選取16例年齡和性別匹配的健康者作為對(duì)照組。其中男10例，女6例；年齡11～36歲，平均(12.78±9.67)歲。對(duì)照組與VKC組在年齡及性別構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。排除全身性疾病、眼部活動(dòng)性炎癥、外傷史、眼部手術(shù)史、佩戴角膜接觸鏡史。

本研究中所有患者均由主治以上醫(yī)師明確診斷。本研究經(jīng)過(guò)暨南大學(xué)附屬?gòu)V州愛(ài)爾眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批編號(hào)：GZAIER2020IRB05)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 臨床檢查

1.2.1 眼表檢查 操作步驟：所有入組者在醫(yī)師指導(dǎo)下完成OSDI干眼問(wèn)卷填寫。利用OCULUS非侵入性眼表綜合分析儀(Keratograph 5M)對(duì)受試者進(jìn)行眼部檢測(cè)。囑咐受試者將下頜置于儀器頜托上，雙眼平視前方，待成功對(duì)焦后，眼表綜合分析儀記錄出眼表數(shù)據(jù)和圖片。所有檢查由同一醫(yī)師檢查3次，取中間值。所有檢查遵循：先進(jìn)行無(wú)刺激性檢查，再進(jìn)行刺激性檢查。

觀察項(xiàng)目：(1)淚河高度(non-invasive tear meniscus height，NITMH)：反映淚液的分泌量。正常值為：0.2～0.35 mm，高淚河≥0.35 mm，低淚河分<0.2 mm。(2)無(wú)創(chuàng)淚膜破裂時(shí)間(non-invasive keratograh breakup time，NIKBUT)：反映淚膜的穩(wěn)態(tài)；正常值為：11～15 s，高標(biāo)準(zhǔn)為>15 s，低標(biāo)準(zhǔn)為<10 s。(3)瞼板腺缺失分級(jí)評(píng)分：瞼板腺體無(wú)缺失為0分；瞼板腺體缺失面積<1/3為1分；1/3≤瞼板腺體缺失面積<2/3為2分，瞼板腺體缺失面積≥2/3為3分。上下瞼得分相加為受檢眼的最終得分。(4)角膜熒光染色(CFS):角膜被劃分為4個(gè)象限。每個(gè)象限按0～3分進(jìn)行評(píng)分。0分：無(wú)點(diǎn)狀染色；1分：染色不足一半；2分：染色大于一半；3分：全染色。每個(gè)象限的評(píng)分進(jìn)行加和獲得總分。(5)眼紅分析：將檢測(cè)儀調(diào)焦至結(jié)膜血管最清晰的位置，采集數(shù)據(jù)。所采集的數(shù)據(jù)經(jīng)R-scan軟件分析后即可顯示出量化的結(jié)膜充血評(píng)分?jǐn)?shù)值。

1.2.2 IVCM檢查 操作步驟：采用海德堡HRT3-CM共焦激光顯微鏡進(jìn)行角膜形態(tài)的觀察。機(jī)器參數(shù)：激光波長(zhǎng)670 nm,觀察視野為400 μm×400 μm，軸向分辨率為1 μm。對(duì)受試者進(jìn)行眼表麻醉(鹽酸丙美卡因滴眼液，美國(guó)Alcon公司)。受試者將下頜放進(jìn)設(shè)備的下頜托處，前額固定于前額托，調(diào)節(jié)CCD攝像頭的位置，使CCD攝像頭的光軸與激光掃描攝像頭的光軸垂直。囑患者注視指示燈，將攝像頭移向患者，直到患者角膜與Rostock角膜接觸帽的距離在5～10 ms之間。調(diào)整物鏡位置，使角膜接觸帽與受試者角膜中央輕微接觸。所有操作由同一醫(yī)師完成。

觀察項(xiàng)目：(1)朗格漢斯細(xì)胞密度：利用IVCM內(nèi)置的細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件計(jì)算中央角膜上皮內(nèi)浸潤(rùn)的朗格漢斯細(xì)胞密度；(2)角膜神經(jīng)：利用IVCM 結(jié)合Image J 軟件對(duì)中央角膜上皮下神經(jīng)叢進(jìn)行計(jì)算和分析；(3)瞼板腺觀察：利用IVCM對(duì)瞼板腺進(jìn)行掃描，觀察瞼板腺腺泡密度和腺泡長(zhǎng)徑。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析及處理，采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。對(duì)于率或構(gòu)成比比較采用2檢驗(yàn)；對(duì)于連續(xù)變量結(jié)果，用 Pearson相關(guān)分析檢驗(yàn)相關(guān)性。P<0.05(雙側(cè))被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼表檢測(cè)結(jié)果 病例組與對(duì)照組眼表檢查結(jié)果比較顯示，多數(shù)的VKC患者符合TFOS DEWS Ⅱ干眼診斷標(biāo)準(zhǔn)(53%vs.21%，P=0.028)。病例組患者OSDI評(píng)分明顯高于對(duì)照組[(29.10±18.72)分vs.(8.36±5.17)分，P<0.001]，見(jiàn)表1。病例組的NITMH較對(duì)照組偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.19±0.06)mmvs.(0.25±0.08)mm，P=0.029]，見(jiàn)表1。病例組的NIKBUT比對(duì)照組偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(8.15±1.74)svs.(11.04±1.87)s,P=0.003]，見(jiàn)表1,圖1。病例組的瞼板腺缺失評(píng)分較對(duì)照組更高[(2.00±0.43)分vs.(0.56±0.49)分，P<0.001]，見(jiàn)圖2。病例組的角膜熒光染色評(píng)分較對(duì)照組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.30±1.18)分vs.(0.36±0.19)分，P=0.031]。眼紅分析檢查結(jié)果病例組的數(shù)值較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.07±0.50)分vs.(0.55±0.16)分,P<0.001]，見(jiàn)表1。

表1 病例組與對(duì)照組眼表檢查結(jié)果

注：顯示VKC患者的NIKBUT偏低，提示淚膜穩(wěn)定性差

注：顯示VKC患者的瞼板腺缺失面積更大

2.2 IVCM檢測(cè)結(jié)果 IVCM顯示病例組瞼板腺腺泡萎縮、腺泡排列欠整齊、腺泡周邊炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡不規(guī)則膨大(圖3-A、B、C)。兩組瞼板腺活體共聚焦顯微鏡分析結(jié)果顯示，VKC患者的瞼板腺腺泡密度較對(duì)照組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049)。此外，VKC患者的腺泡長(zhǎng)徑、腺泡短徑、腺泡周邊炎癥細(xì)胞密度分別與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表2。

表2 兩組瞼板腺活體共聚焦顯微鏡分析結(jié)果比較

IVCM顯示大部分VKC患者的角膜上皮最表層的鱗狀細(xì)胞消失，僅可見(jiàn)基質(zhì)層細(xì)胞(圖3-D)；同時(shí)，VKC患者角膜上皮下可見(jiàn)大量朗格漢斯細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3-E)，較對(duì)照組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。IVCM顯示VKC患者的角膜上皮下神經(jīng)叢密度降低，神經(jīng)纖維變細(xì)，彎曲度增加(圖3-F)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：VKC患者的朗格漢斯細(xì)胞密度、中央角膜神經(jīng)密度及角膜神經(jīng)直徑與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

注：A:瞼結(jié)膜可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn); B:瞼板腺腺泡周圍可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn); C:瞼板腺腺泡膨大，呈現(xiàn)不規(guī)則; D:角膜上皮最表層的鱗狀細(xì)胞消失; E:瞼結(jié)膜可見(jiàn)大量朗格漢斯細(xì)胞浸潤(rùn); F:角膜神經(jīng)叢密度下降，神經(jīng)纖維變細(xì)及彎曲度增加

表3 兩組角膜上皮下朗格漢斯細(xì)胞及神經(jīng)叢活體共聚焦顯微鏡分析結(jié)果比較

2.3 相關(guān)性分析 對(duì)瞼板腺腺泡密度和腺泡長(zhǎng)徑這兩項(xiàng)檢測(cè)的各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，中央角膜神經(jīng)密度與瞼板腺腺泡密度呈正相關(guān)(R2=0.197，P=0.044)，與腺泡長(zhǎng)徑呈負(fù)相關(guān)(R2=0.46，P<0.001)。見(jiàn)圖4～5。

圖4 中央角膜神經(jīng)密度與瞼板腺腺泡密度的關(guān)系

圖5 中央角膜神經(jīng)密度與腺泡長(zhǎng)徑的關(guān)系

3 討論

VKC是Ⅰ型及Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)共同參與的眼表炎癥，以瞼結(jié)膜的乳頭增生或角膜緣的膠凍樣增生為主要表現(xiàn)，?？衫奂敖悄1]，全球過(guò)敏性結(jié)膜炎患病率約為10%[13]。VKC常會(huì)影響到患者的生活質(zhì)量和工作，目前VKC的診斷包括癥狀體征評(píng)估和實(shí)驗(yàn)室輔助檢查，檢查方法包括結(jié)膜刮片細(xì)胞檢查，淚液或血液IgE抗體檢測(cè)，過(guò)敏原應(yīng)激實(shí)驗(yàn)等[15-16]。盡管這些檢查對(duì)VKC診斷有較高的特異性，但是并未對(duì)VKC患者的眼表及角膜進(jìn)行全面評(píng)估。本研究參照DESWⅡ推薦的干眼診斷方法和流程，從淚膜和角膜形態(tài)改變?yōu)槌霭l(fā)點(diǎn)，闡述VKC與干眼的關(guān)系以及VKC患者的角膜病理學(xué)改變。

有研究顯示，眼表屏障的完整性是維持免疫平衡的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[17]。外界過(guò)敏原若要與結(jié)膜的免疫細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，就必須穿過(guò)結(jié)膜上皮達(dá)到黏膜下。VKC常伴隨著眼表細(xì)胞質(zhì)因子和炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放，并且促進(jìn)角膜基質(zhì)層纖維細(xì)胞釋放趨化因子和黏附分子，如組胺，IL-4，TNF-α等，進(jìn)而加重過(guò)敏反應(yīng)[18]。這些可以導(dǎo)致結(jié)膜杯狀細(xì)胞及角膜上皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而合并眼表屏障的損害并加速免疫反應(yīng)過(guò)程[19]。本研究通過(guò)IVCM觀察到16例VKC患者角膜上皮最表層的高亮鱗狀細(xì)胞消失，提示VKC患者的眼表屏障受損。這種上皮細(xì)胞的異常形態(tài)可能會(huì)加速外界致敏原與眼表的免疫細(xì)胞的反應(yīng)。

VKC的發(fā)病過(guò)程是多種機(jī)制破壞眼表免疫的綜合作用過(guò)程，其中炎癥因子起到重要作用。TNF-α和IL-1激活樹(shù)突狀抗原遞呈細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生活化分子，包括MHC Ⅱ抗原、VEGFr3等[19-21]。本研究通過(guò)IVCM發(fā)現(xiàn)VKC患者角膜上皮下可見(jiàn)大量朗格漢斯細(xì)胞浸潤(rùn)，較對(duì)照組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，這也驗(yàn)證了VKC患者角膜存在免疫炎癥反應(yīng)。朗格漢斯細(xì)胞屬于樹(shù)突細(xì)胞群體，是免疫反應(yīng)中主要的抗原呈遞細(xì)胞。朗格漢斯細(xì)胞將外界抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞，參與了VKC的病理過(guò)程。以往，在活體很難對(duì)朗格漢斯細(xì)胞進(jìn)行觀察，IVCM的應(yīng)用為我們?cè)诨铙w觀察VKC角膜組織病理變化提供了可能性，并為闡述病理過(guò)程提供了依據(jù)。

VKC患者常合并干眼，Kumar 等[5]報(bào)道了春季為過(guò)敏性結(jié)膜炎發(fā)生的高峰，3、4月份同為干眼診斷的季節(jié)性高峰，從另一個(gè)側(cè)面說(shuō)明，這兩者可能有著較密切的關(guān)系。Hom 等[7]在他們的研究中報(bào)告了57.7%的過(guò)敏性結(jié)膜炎的患者合并干眼，45.3%的干眼患者有眼癢癥狀。我們的研究顯示，VKC組的瞼板腺缺失評(píng)分較對(duì)照組更高(P<0.001)，眼表屏障的淚膜穩(wěn)定性的改變可能也參與了VKC的病程。

本研究參照2017年DEWS Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)，采用Keratograph 5M對(duì)患者進(jìn)行眼表分析，結(jié)果顯示VKC患者淚河、BUT較正常人明顯降低，角膜熒光染色評(píng)分較正常人增加，VKC患者瞼板腺缺失較正常人增加。這些評(píng)價(jià)干眼的重要指標(biāo)都表明了VKC患者合并淚膜穩(wěn)定性下降；IVCM結(jié)果也顯示瞼板腺腺泡密度下降、腺泡間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，本研究通過(guò)IVCM對(duì)患者的角膜神經(jīng)叢進(jìn)行觀察，VKC患者與正常人相比，角膜上皮下神經(jīng)纖維細(xì)且密度下降，同時(shí)神經(jīng)彎曲度明顯增加，中央角膜神經(jīng)密度與瞼板腺腺泡密度呈正相關(guān)，與腺泡長(zhǎng)徑呈負(fù)相關(guān)。新的DEWS Ⅱ干眼指南指出，神經(jīng)知覺(jué)的改變是導(dǎo)致干眼的重要因素。正常人通過(guò)反射性淚液和瞬目過(guò)程，可以將眼球表面的有害物質(zhì)(包括致敏物質(zhì))清除[22-23]。結(jié)合本研究結(jié)果，我們認(rèn)為VKC患者角膜神經(jīng)纖維的改變，導(dǎo)致反射性淚液的減少，進(jìn)而減緩了有害物質(zhì)的清除，加速了VKC的過(guò)程。瞼板腺的宏觀和微觀的共同改變說(shuō)明了，瞼板腺功能的異常參與了VKC的干眼進(jìn)程[24]。這可能提示我們隨著病情的發(fā)展，VKC患者可能表現(xiàn)為混合型干眼。

利益相關(guān)聲明：所有作者一致聲明無(wú)利益沖突存在。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：張賽賽直接參與醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析解釋數(shù)據(jù)并起草論文與統(tǒng)計(jì)分析。李東豪對(duì)論文的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)。唐細(xì)蘭直接參與分析解釋數(shù)據(jù)并指導(dǎo)。洪滿珠指導(dǎo)工作。