王世信，楊美娜，崔友祥，丁洪青

（1. 河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 中藥藥學(xué)部，河北 滄州 061001；2. 河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 腦病三科，河北 滄州 061001）

芪參還五膠囊是由經(jīng)典方劑補(bǔ)陽還五湯發(fā)展而來，是中藥復(fù)方制劑，有清熱養(yǎng)陰、息風(fēng)化痰、祛瘀通絡(luò)、補(bǔ)氣活血功效[1-2]。臨床常用于治療身疲乏力、頭痛半身不遂、胸痹、頭暈、中風(fēng)、胸痛、胸悶、眩暈等[3]。傳統(tǒng)的湯劑攜帶困難，患者服用的順應(yīng)性較差且易變質(zhì)[4]，因此將湯劑制成膠囊劑更方便患者使用[5]。經(jīng)過研究總結(jié)，黃芪、桃仁、紅花、當(dāng)歸等藥物的有效成分在水中均有較好的溶解度，選擇水煎提取法；黃芪和赤芍為主藥，故選擇毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)[6-7]。應(yīng)用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)對(duì)芪參還五膠囊的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為該制劑的制備選擇合理的提取工藝，為該制劑的大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1 材料與儀器

黃芪、桃仁、紅花、當(dāng)歸、赤芍、川芎、玄參、石決明、鉤藤、麥冬、連翹、地龍（甘肅安泰堂醫(yī)藥有限公司），經(jīng)滄州市藥品檢驗(yàn)所鑒定合格。芍藥苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（天津一方科技有限公司）。甲醇、乙腈均為色譜純，其余相關(guān)試劑為分析純。高效液相色譜儀（SmMADZU LC.15C）；色譜柱[依利特Hypersil ODS2 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]；電子分析天平（AGl35）及各種常規(guī)儀器。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照處方量，稱取黃芪、桃仁、紅花、當(dāng)歸、赤芍、川芎、玄參、石決明、鉤藤、麥冬、連翹、地龍，共9份。選擇加水倍數(shù)、提取時(shí)間和提取次數(shù)作為主要考察因素，每個(gè)因素考察3個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，以干膏得率作為主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。考察因素見表1。

表1 提取條件正交試驗(yàn)因素水平表

2.2 樣品測(cè)定方法學(xué)

2.2.1 高效液相法條件 色譜柱：依利特Hypersil ODS2 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1 %磷酸水溶液（B）（21:79）；柱溫：30 ℃，流速：1 ml/min，波長(zhǎng)230～260 nm；進(jìn)樣量：10 μl，分析時(shí)間為80 min。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取芪參還五膠囊內(nèi)容物約5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 ml，稱定質(zhì)量，放置過夜，50 ℃超聲處理 1 h，放冷，濾過，濾液濃縮至干，用甲醇溶解并定容至5 ml，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按本品的處方比例參照最優(yōu)制備工藝，配制不含赤芍、黃芪的陰性樣品，按2.2.3項(xiàng)方法制備陰性對(duì)照液。

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別取對(duì)照品溶液1，2，3，4，5，6 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻配制成濃度分別為30，60，90，120，150，180 μg/ml溶液，分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，按2.2.1項(xiàng)色譜條件，分別測(cè)定芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量（x/μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，求得芍藥苷回歸方程，y=5×106x＋11086，r=0.9998，線性范圍為30～180 μg/ml；求得毛蕊異黃酮葡萄糖苷回歸方程，y=4.32×106x＋9823，r=0.9996，線性范圍為30～180 μg/ml。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按2.2.1項(xiàng)色譜條件，測(cè)定6次，記錄峰面積，計(jì)算芍藥苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.23 %，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.21 %，均符合要求。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μl，于0，2，4，8，12，24 h注入液相色譜儀，按2.2.1項(xiàng)色譜條件，記錄峰面積，計(jì)算芍藥苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.42 %，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.89 %，均符合要求。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取芪參還五膠囊內(nèi)容物，按供試品制備方法制備6份樣品供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)色譜條件，計(jì)算峰面積。計(jì)算芍藥苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.05 %，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.84 %，均符合要求。

2.2.9 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取芪參還五膠囊內(nèi)容物6份，精密加入一定量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷對(duì)照品溶液，制成供試品溶液。采用加樣回收率試驗(yàn)，取同一批樣品設(shè)高、中、低3個(gè)濃度，每個(gè)濃度平行3份，各濃度水平加入對(duì)照品的量與所取供試品含量之比分別為1:1.5，1:1，1:0.5，測(cè)定峰面積。計(jì)算芍藥苷的回收率為98.49 %，RSD為0.52 %，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的回收率為101.16 %，RSD為0.79 %，均符合要求。

2.2.10 樣品的測(cè)定 將各實(shí)驗(yàn)收集的溶液進(jìn)行水浴蒸干，并將殘?jiān)糜?05 ℃烘箱干燥。精密稱取正交實(shí)驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)所得到的干膏重量，計(jì)算干膏率；并精密稱取各樣品適量，參考2.2.3項(xiàng)的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，過0.22 μm微孔濾膜，取10 μl濾液進(jìn)樣分析，結(jié)果見表2。對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)表

表3 兩藥含量方差分析

當(dāng)以毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，通過極差分析，對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷含量的主要影響因素為提取次數(shù)，其次為提取時(shí)間和加水量；方差分析結(jié)果表明，提取次數(shù)是對(duì)提取工藝影響最大的影響因素；通過對(duì)數(shù)值大小進(jìn)行直觀比較，A2B3C2為最佳提取工藝。

當(dāng)以干膏率作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，通過極差分析，主要影響因素為提取次數(shù)，其次為提取時(shí)間和加水量；方差分析表明，提取次數(shù)是影響提取工藝的主要因素，通過對(duì)干膏率進(jìn)行數(shù)據(jù)直觀分析，最佳提取工藝為A3B3C2。

對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合考慮，為了節(jié)約工時(shí)和成本，并達(dá)到最大的有效成分提取率和干膏率，最終選擇最佳工藝為A2B3C3，即加入藥材10倍的水，每次提取2 h，共提取3次。

2.3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

按照處方量稱取藥物3份，按照選取的最佳提取工藝進(jìn)行提取，3次獲得的干膏率分別為44.12 %，45.39 %和44.29 %，芍藥苷的含量分別為185.32，178.29和182.31 μg/g，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量分別為163.93，158.28和159.37 μg/g，RSD值分別為1.54 %，1.93 %和1.87 %（n=3）。結(jié)果表明，應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)芪參還五膠囊的制備工藝進(jìn)行篩選，得到干膏率、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷含量較高的制備方法。該工藝穩(wěn)定可行、科學(xué)合理可以用于大生產(chǎn)。

3 討論

補(bǔ)陽還五湯出自清代醫(yī)家王清任之書寫的《醫(yī)林改錯(cuò)》，處方主要由四兩生黃芪、二錢當(dāng)歸尾、一錢半赤芍、一錢地龍、一錢川芎、一錢紅花和一錢桃仁組成[8]，是體現(xiàn)益氣活血治法的代表藥方，常用于治療中風(fēng)后遺癥[9-10]。本處方臨床療效較好[11]，主要用于治療中風(fēng)，患者的常見證狀為舌暗苔白脈緩、遺尿不禁、小便頻數(shù)、口角流涎、語言謇澀、口眼歪斜、肢體麻木和半身不遂[12-13]。具有補(bǔ)氣、通絡(luò)、活血的功效，主要通過大補(bǔ)元?dú)?，輔助以活血通絡(luò)。

芪參還五膠囊[14]藥物成分的固體顆粒形式，大大方便儲(chǔ)存和運(yùn)輸；顆粒制劑藥物含水量少，藥物不易腐敗變質(zhì)，增加了藥物的儲(chǔ)存時(shí)間，患者可一次獲得多日劑量；膠囊形式也較好地提升了患者的順應(yīng)性。

本文對(duì)本處方進(jìn)行HPLC方法驗(yàn)證，結(jié)果表明，色譜峰形較好，分離度足夠，且線性、精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率等項(xiàng)目均符合要求，表明此法能對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷進(jìn)行很好的定性和定量分析。對(duì)制備芪參還五膠囊的工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，該提取工藝所得產(chǎn)品的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芍藥苷含量較高，所得干膏的量較多，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好，為芪參還五膠囊的進(jìn)一步研究提供了技術(shù)支持。