馬 燕，李芯國，毛福英,2，余建強(qiáng),3,4，趙云生,2,4，趙建軍,3,4

（1寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，銀川 750004；2河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，石家莊 050200；3寧夏特色中醫(yī)藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，銀川 750004；4寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

0 引言

黃芪是中國常用大宗藥材，為豆科植物蒙古黃芪(Astragalus membranaceusvar.mongholicus)或膜莢黃芪(A.membranaceus)的干燥根[1]，中藥臨床與保健品市場需求量巨大。寧夏六盤山地區(qū)氣候冷涼，黃芪生產(chǎn)歷史悠久，隆德縣是著名的“原州黃芪”的核心產(chǎn)區(qū)，其獨(dú)特的地理環(huán)境孕育了寧夏黃芪優(yōu)良的品質(zhì)。采收期是保證原州黃芪質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一，然而產(chǎn)區(qū)部分群眾在利益驅(qū)動(dòng)下根據(jù)需要隨時(shí)采挖，導(dǎo)致原州黃芪質(zhì)量下降，確定合理采收期是解決上述問題的有效途徑。黃芪含有多種活性成分，包括多糖、皂苷與黃酮類成分等[2]，其中黃芪甲苷對缺血造成的心腦損傷具有保護(hù)性作用，具有抗病毒、降糖等活性[3-4]；毛蕊異黃酮、芒柄花黃素及其糖苷等成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗損傷、抗突變、抗腫瘤、抑制動(dòng)脈粥樣硬化等活性[5]；刺芒柄花苷具有促進(jìn)皮膚生長、抑制脂質(zhì)過氧化、清除氧自由基、維持血中NO濃度等藥理活性[6]。陜西子洲產(chǎn)黃芪，黃芪甲苷含量6月最高，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和總黃酮含量5月最高[7]。陜西省橫山縣1年生蒙古黃芪總黃酮與總皂苷含量以9月下旬與10月上旬較高[8]。山西渾源4年生蒙古黃芪于9月下旬采收，黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ總含量高于其他采收期而具有較高的利用價(jià)值[9]。甘肅渭源蒙古黃芪8月上旬采收總黃酮與總皂苷含量最高，9月上旬—10月初采收總浸出物含量最高[10]，黃芪甲苷含量以休眠期（11月中旬）和萌動(dòng)期（3月末）最高[11]。青海省民和縣蒙古黃芪秋季采收，其黃酮類成分高于春季，而黃芪甲苷含量顯著低于春季[12]。隴西和渾源種源的黃芪根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量在9月達(dá)到峰值，而芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花黃素含量呈波動(dòng)變化[13]。不同產(chǎn)地的藥材合理采收期并不一致，明確不同采收期黃芪藥效成分的含量變化規(guī)律，是黃芪質(zhì)量控制的重中之重，然而目前關(guān)于寧夏六盤山黃芪質(zhì)量評價(jià)與合理采收期的研究較少。筆者選擇六盤山地區(qū)黃芪的典型生產(chǎn)基地寧夏隆德縣為藥材采集地，采用指紋圖譜與黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花黃素、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮含量評價(jià)不同采收期黃芪藥材的質(zhì)量差異[14-15]，以期確定采收期對寧夏六盤山冷涼地區(qū)黃芪質(zhì)量的影響，為寧夏六盤山冷涼地區(qū)栽培黃芪的合理采收提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），二極管陣列檢測器(DAD)，蒸發(fā)光檢測器(ELSD)、十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司），數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，250 W，40 kHz），索氏提取器。

1.2 試劑

對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號14110905）、刺芒柄花苷（批號15052010）、毛蕊異黃酮（批號14121511）、芒柄花黃素（批號15061408）均購自成都思天德生物科技有限公司，黃芪甲苷（批號17022804）購自成都曼思特生物公司，所有對照品純度均大于98%。

甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

黃芪藥材均于2018年采自寧夏隆德縣沙塘鎮(zhèn)，由寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院趙建軍采集并鑒定為蒙古黃芪，藥材采集時(shí)間信息見表1。

表1 黃芪藥材采集時(shí)間信息表

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 指紋圖譜色譜條件

色譜柱為YMC-PackODS-A-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，12 nm)；流動(dòng)相A相為甲醇和乙腈，B相為醋酸緩沖鹽(pH 4.5)，梯度洗脫條件見表2；DAD檢測器，檢測波長260 nm，流速0.6 mL/min，柱溫25℃[16-18]。

表2 黃芪藥材HPLC梯度洗脫條件

2.2 黃芪甲苷測定色譜條件

Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈:水(32:68)，等度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫25℃；進(jìn)樣量10 μL。ELSD檢測器空氣流量為1.6 L/min，漂移管溫度30℃[19-20]。

2.3 供試品溶液的制備

取黃芪藥材粉末約1 g（過四號篩），精密稱定，置索氏提取器中加適量甲醇冷浸12 h，加甲醇120 mL于90℃提取150 min，減壓濃縮提取液至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? mL容量瓶中。

2.4 對照品溶液的制備

2.4.1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品2.25 mg，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（含毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.45 mg/mL）。

2.4.2 刺芒柄花苷對照品溶液的制備 精密稱取刺芒柄花苷對照品0.9 mg，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（含刺芒柄花苷0.18 mg/mL）。

2.4.3 毛蕊異黃酮對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮對照品1.7 mg，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到含毛蕊異黃酮0.34 mg/mL的溶液，精密量取此溶液0.2 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（含毛蕊異黃酮0.0136 mg/mL）。

2.4.4 芒柄花黃素對照品溶液的制備 精密稱取芒柄花黃素對照品0.8 mg，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到含芒柄花黃素0.16 mg/mL的溶液，精密量取此溶液1 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（含芒柄花黃素0.032 mg/mL）[21]。

2.4.5 黃芪甲苷對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品2.65 mg，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻（含黃芪甲苷0.53 mg/mL），保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別取毛蕊異黃酮葡萄糖苷5、8、15、20、25 μL，刺芒柄花苷12、15、18、20、23、25 μL，黃芪甲苷5、8、10、15、17、20 μL，毛蕊異黃酮與芒柄花黃素7、10、13、16、20、25 μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別建立毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮與芒柄花黃素回歸方程。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)回歸方程的建立

黃芪中5種待測成分回歸方程建立結(jié)果見表3，各回歸方程R2均大于0.999，說明各方程回歸良好，可用于黃芪藥材中5種待測成分的含量測定。

表3 黃芪中5種待測成分標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取編號為S4的黃芪藥材，按2.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，依據(jù)2.1與2.2項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣10 μL，分別測定指紋圖譜與黃芪甲苷含量，考察儀器的精密度，測得指紋圖譜各共有峰與黃芪甲苷相對保留時(shí)間RSD值均小于1%，相對峰面積與黃芪甲苷含量RSD值均小于2.2%，表明儀器精密度良好。

3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取編號為S4的黃芪藥材，按2.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，依據(jù)2.1與2.2項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10 μL測定其指紋圖譜與黃芪甲苷含量，考察實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性，測得指紋圖譜各共有峰與黃芪甲苷相對保留時(shí)間RSD值均小于1%，相對峰面積與黃芪甲苷含量RSD值均小于2.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取編號為S11黃芪藥材，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依據(jù)2.1與2.2項(xiàng)下色譜條件，分別在0、4、8、12、24 h各進(jìn)樣10 μL測定其指紋圖譜與黃芪甲苷含量，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。測得指紋圖譜各共有峰與黃芪甲苷相對保留時(shí)間RSD值均小于1%，相對峰面積與黃芪甲苷含量RSD值均小于2.4%，說明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取編號為S4黃芪藥材粉末0.5 g，精密稱定，根據(jù)表4“加入量”列分別精密加入一定質(zhì)量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素與黃芪甲苷，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1與2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4，各樣品加樣回收率95.55%～99.65%，RSD值均小于2.52，表明各待測成分加樣回收率良好。

表4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.6 黃芪藥材HPLC指紋圖譜的建立

將14批黃芪藥材按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2004A)”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，設(shè)定S1為參照圖譜，將其他樣品的色譜峰與參照圖譜進(jìn)行自動(dòng)匹配，生成對照圖譜(R)，建立黃芪藥材指紋圖譜色譜圖（圖1）。14批不同采收時(shí)間黃芪藥材指紋圖譜中各色譜峰形態(tài)相似，化合物種類相似，有15個(gè)共有色譜峰，共有峰圖譜見圖2，其中9號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，12號峰為刺芒柄花苷，14號峰為毛蕊異黃酮，15號峰為芒柄花黃素。

圖1 14批不同采收時(shí)間黃芪藥材指紋圖譜

圖2 14批不同采收時(shí)間黃芪藥材指紋圖譜共有色譜峰

3.6.1 不同采收時(shí)間黃芪指紋圖譜相似度 采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2004A)”，對14批不同采收時(shí)期黃芪藥材HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度評價(jià)，結(jié)果見表5。14批不同采收時(shí)期黃芪藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜相比，相似度均高于0.927，說明不同采收時(shí)間黃芪藥材相似度較高，結(jié)合圖1指紋圖譜測定結(jié)果可知，不同采收時(shí)間，黃芪藥材藥效成分的種類相似，采收時(shí)間對黃芪藥效成分種類影響不大。

表5 不同采收時(shí)間黃芪藥材指紋圖譜與對照圖譜相似度

3.6.2 不同采收時(shí)間黃芪指紋圖譜共有峰總峰面積 不同采收時(shí)間黃芪共有峰總峰面積差異較大。由圖3可知，2018年5月20日、5月31日、6月10日、10月1日與10月10日，黃芪指紋圖譜共有峰總峰面積較大，高于其他9個(gè)采收時(shí)間的黃芪，因而在上述時(shí)間采收的黃芪，化學(xué)成分總含量較高。

圖3 不同采收時(shí)間黃芪指紋圖譜共有峰總峰面積

3.6.3 不同采收時(shí)間黃芪指紋圖譜聚類分析 以15個(gè)共有峰的峰面積為變量，運(yùn)用SPSS 21.0軟件，采用組間連接，平方Euclidean距離，對14個(gè)不同采收期的黃芪藥材進(jìn)行聚類分析（圖4）。14個(gè)不同采收期的黃芪藥材可分為4類，S1與S2為一類，S13與S14為一類，S3、S5、S7、S11、S12為一類，S4、S6、S8、S9、S10為一類。即采收期為5月20日與5月31日的黃芪聚為一類，采收日期為10月1日與10月10日的黃芪聚為一類，可見采收期在5月或10月的黃芪化學(xué)成分類似，這2個(gè)時(shí)期黃芪中指紋圖譜總峰面積亦較高，因而5月中下旬與10月上旬采收的黃芪質(zhì)量一致性較好，藥效物質(zhì)含量較高[22]。

圖4 14批黃芪樣品聚類分析樹狀圖

3.6.4 不同采收時(shí)間黃芪指紋圖譜主成分分析 主成分分析能夠在保持?jǐn)?shù)據(jù)原有信息不丟失的基礎(chǔ)上直觀地從投影圖上看出樣本的分類情況，找到數(shù)據(jù)的最主要影響因素。為直觀體現(xiàn)不同采收期黃芪藥材的差異性，本研究將14批不同采收時(shí)間黃芪指紋圖譜中15個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS 21.0進(jìn)行主成分分析(PCA)，計(jì)算特征值和方差貢獻(xiàn)率（表6），并以特征值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，提取出4個(gè)主成分，得到4個(gè)主成分的特征值分別為8.586、2.593、1.237、1.021，方差貢獻(xiàn)率分別為57.243%、17.284%、8.249%、6.808%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為89.584%，表明這4個(gè)主成分可以代表樣品原始成分89%以上的信息[23-25]。

表6 黃芪指紋圖譜主成分分析特征值和方差貢獻(xiàn)率

成分載荷矩陣反映了各主成分與指紋圖譜共有峰的相關(guān)性。由表7可知，主成分1與指紋圖譜共有峰F3～F12的相關(guān)性較強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)均高于0.783，與F7、F8及F4的相關(guān)系數(shù)最高，均高于0.914，指紋圖譜共有峰中F9為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，F(xiàn)12為刺芒柄花苷，主成分1與這2個(gè)成分的相關(guān)系數(shù)遠(yuǎn)高于其他主成分。主成分2與指紋圖譜共有峰F1、F14（毛蕊異黃酮）及F15（芒柄花黃素）相關(guān)系數(shù)較高，均高于0.7以上。主成分3與指紋圖譜共有峰F13相關(guān)系數(shù)較高，為0.568。主成分4與指紋圖譜共有峰F2相關(guān)系數(shù)較高，為0.551。

表7 黃芪指紋圖譜主成分載荷矩陣

根據(jù)主成分特征值與載荷矩陣計(jì)算14批藥材樣品的主成分得分，以主成分1、2、3的得分分別為Z1、Z2與Z3軸，繪制14批不同采收時(shí)間藥材主成分得分圖，結(jié)果見圖5，不同采收時(shí)間的黃芪，S1與S2聚為一類，S13與S14聚為一類，分類結(jié)果與圖3聚類分析結(jié)果基本一致，可見采收時(shí)間為5月20日與5月31日的藥材質(zhì)量較為一致，采收時(shí)間為10月1日與10月10日的藥材質(zhì)量較為一致，這2個(gè)分類群藥材指紋圖譜共有峰總峰面積也較大，質(zhì)量較好。

圖5 14個(gè)采收時(shí)間黃芪主成分得分圖

3.7 不同采收期黃芪中5種成分的含量測定

取14批不同采收時(shí)間黃芪藥材，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素、黃芪甲苷含量，測定結(jié)果如表8所示。

表8 不同采收時(shí)間黃芪中5種成分含量測定結(jié)果 %

在14批不同采收時(shí)間的黃芪樣品中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為0.0209%～0.0552%，以S1、S2、S13與S14（5月與10月樣品）含量為高，均高于0.0448%，以S10含量最低。各樣品中黃芪刺芒柄花苷含量0.0020%～0.0399%，以S1、S2、S5含量為高，以S9含量最低。黃芪毛蕊異黃酮含量0.0202%～0.0951%，以S4、S5、S11與S13為高，以S8含量最低。黃芪芒柄花黃素含量0.0189%～0.0792%，以S4、S5芒柄花黃素含量為高，S8最低。不同采收時(shí)間黃芪甲苷含量為0.0642%～0.4788%，以S13與S14含量為高，均高于0.3094%，S8含量最低。可見本研究所測定的5種成分中，并不是在10月或5月采收的黃芪樣品中含量均最高，其中刺芒柄花苷在5—6月含量較高，以5月20日采收含量最高，毛蕊異黃酮與芒柄花黃素均在6月下旬采收含量最高，但10月與5月采收的黃芪樣品中，黃芪主要藥效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷與黃芪甲苷含量較高，此時(shí)黃芪指紋圖譜共有峰總峰面積亦較高，說明這2個(gè)時(shí)期采收的黃芪藥材品質(zhì)優(yōu)良。

4 結(jié)論

HPLC指紋圖譜研究結(jié)果表明不同采收時(shí)間黃芪藥材相似度較高，藥效成分種類相似，采收時(shí)間對黃芪藥效成分種類影響不大。黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷與黃芪甲苷是2020年版《中國藥典》要求檢測的指標(biāo)成分[1]，在5月(S1、S2)采收的黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷與刺芒柄花苷含量較高，指紋圖譜共有峰總峰面積最大，在10月(S13、S14)采收的黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷與黃芪甲苷含量較高，指紋圖譜共有峰總峰面積略低于5月采收的黃芪，但高于其他月份采收的黃芪，可見，寧夏六盤山冷涼地區(qū)產(chǎn)蒙古黃芪在10月與5月采收，藥效物質(zhì)含量較高，品質(zhì)優(yōu)良，此結(jié)論與不同采收時(shí)間黃芪指紋圖譜聚類分析和主成分分析結(jié)果一致。

5 討論

寧夏是中國黃芪主產(chǎn)區(qū)之一，是著名的原州黃芪的主產(chǎn)地，然而，根據(jù)本草記載，原州黃芪的基原應(yīng)為膜莢黃芪(A.membranaceus)[26]，膜莢黃芪目前在寧夏僅零星分布，是野生藥材，不是寧夏黃芪藥材的主流商品，作為原州黃芪的主要基原，應(yīng)加強(qiáng)膜莢黃芪的引種栽培與合理采收研究，以壯大隆德縣等六盤山冷涼地區(qū)黃芪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，寧夏黃芪主產(chǎn)區(qū)大量種植的是蒙古黃芪(A.membranaceus var.mongholicus)，對于在寧夏冷涼地區(qū)生產(chǎn)的蒙古黃芪的質(zhì)量與采收時(shí)間，研究并不深入，本研究結(jié)果補(bǔ)充了這方面研究的不足，然而本研究并未進(jìn)行11月與1—4月黃芪采收期研究，此時(shí)期處于休眠期與萌發(fā)前的黃芪生長階段，在六盤山冷涼地區(qū)，此階段生產(chǎn)中已很少采收黃芪，但加強(qiáng)這一時(shí)期的研究，將有助于全面掌握優(yōu)質(zhì)黃芪采收的合理時(shí)間，下一階段有必要開展這方面研究。黃芪中藥效物質(zhì)豐富，其所含成分隨時(shí)間的變化趨勢并不完全相同，有些化學(xué)成分的含量隨生長時(shí)間的變化差異較大，因而黃芪合理采收期的確定還應(yīng)考慮所采收黃芪的使用目的，如果以獲取毛蕊異黃酮與芒柄花黃素等特定成分為目標(biāo)，則應(yīng)具體根據(jù)該特定成分的含量變化確定合理采收期。