劉 晶，胡 曉，楊賢慶，*，陳勝軍，吳燕燕，李來(lái)好，戚 勃，鄧建朝

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306； 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300)

龍須菜()屬于紅藻門(mén)、杉藻目、江蘺屬植物。龍須菜是我國(guó)第三大經(jīng)濟(jì)藻類(lèi)，分支多且生長(zhǎng)快、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)。由于其含膠量高，早期主要被用作提取瓊脂的原料。近年來(lái)，研究者多對(duì)龍須菜源多糖進(jìn)行研究，已證明具有抗病毒、抗腫瘤活性、免疫調(diào)節(jié)作用、抗衰老作用等在內(nèi)的多種活性，但對(duì)龍須菜蛋白的研究較少。隨著對(duì)龍須菜了解的深入，發(fā)現(xiàn)龍須菜不僅蛋白質(zhì)含量高，而且必需氨基酸所占比例高(占總氨基酸含量的35.5%)、種類(lèi)齊全，還含有具有生理活性的?；撬幔菭I(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白質(zhì)資源。此外，龍須菜藻膽蛋白還具有清除自由基、抗腫瘤及提高小鼠免疫能力的活性作用。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，人類(lèi)攝入蛋白質(zhì)后，消化道的酶將其分解為小肽或氨基酸，絕大多數(shù)以小肽的形式消化吸收，少數(shù)以游離氨基酸形式吸收。生物活性肽是一種介于2～20個(gè)氨基酸的序列，分子量通常小于6 ku。由于氨基酸組成的多樣化，使其具有多種生物活性，包括抗氧化、抗凍、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等功能。

蛋白質(zhì)提取的方法常有滲透法、浸漬法、凍融法、均質(zhì)法和溶劑萃取、超聲破碎和纖維素酶法等。其中超聲運(yùn)用頻率大于20 kHz的聲波產(chǎn)生壓縮和減壓，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生破碎、侵蝕、聲毛細(xì)血管效應(yīng)、聲穿孔、局部剪切應(yīng)力和植物細(xì)胞壁基質(zhì)的破壞性損傷。本實(shí)驗(yàn)將超聲輔助堿提酸沉法運(yùn)用在龍須菜蛋白質(zhì)的制備上。超聲波輔助法具有操作便利，提取時(shí)間短，溶劑消耗小，得率高等優(yōu)勢(shì)，作用于大型海藻細(xì)胞壁，可增加組織的多孔性和滲透性，提高蛋白溶出效果，并獲得溶解性和乳化性較好的蛋白質(zhì)。以液固比、堿濃度、超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響實(shí)施單因素實(shí)驗(yàn)。依據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到回歸模型以及各因素交互作用的響應(yīng)面3D圖和等高線(xiàn)圖，確定出最優(yōu)龍須菜粗蛋白質(zhì)提取工藝方案。制備出龍須菜蛋白質(zhì)，并測(cè)定其氨基酸組成。此外，分別使用5種酶(木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、植物蛋白復(fù)合酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶)對(duì)龍須菜蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，測(cè)定酶解產(chǎn)物的抗氧化活性和分子量分布。并利用紅外光譜掃描比較龍須菜蛋白質(zhì)及其酶解物的結(jié)構(gòu)特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍須菜()，廣東省汕頭市南澳島采收，于60 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎過(guò)80目篩，密封保存；BCA試劑盒，南京建成生物有限公司；木瓜蛋白酶，堿性蛋白酶，植物蛋白復(fù)合酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基，2，2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽，Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司；2，4，6-三(2-吡啶基)三嗪，Adamas(上海)貿(mào)易有限公司；NaOH、濃鹽酸、濃硫酸、石油醚、無(wú)水乙醇等均為分析純。

Kjeltec TM 2 300型蛋白自動(dòng)分析儀，丹麥FOSS公司；BioTek全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司；JY99LLDN超聲波細(xì)胞粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；3K30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；Delta320精密pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器( 上海) 公司；Alpha1-4真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；日立835-50型高速氨基酸自動(dòng)分析儀，日本日立公司；SHZ·82A水浴恒溫振蕩器，精達(dá)儀器制造有限公司；LC-20AD高效液相色譜儀，日本島津SHINADZU公司；IRAffinity-1紅外光譜儀，日本島津SHINADZU公司。

1.2 龍須菜蛋白制備工藝

稱(chēng)取適量龍須菜粉末，按照一定液固比加入NaOH，在適當(dāng)條件下采用超聲輔助堿提法處理，得到粗提取液在10 000 r·min，4 ℃下離心15 min，取上清液，即為龍須菜蛋白質(zhì)提取液，測(cè)定蛋白含量，并計(jì)算龍須菜蛋白提取率。之后用0.1 mol·LHCl調(diào)節(jié)pH至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，靜置2 h后在10 000 r·min，4 ℃下離心15 min，收集沉淀，加超純水溶解，用0.1 mol·LNaOH調(diào)pH至中性，透析脫鹽，冷凍干燥得龍須菜粗蛋白，-20 ℃下密封保存。

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，分別研究超聲功率、超聲時(shí)間、液固比和堿濃度4個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)提取效果的影響。蛋白質(zhì)提取的因素設(shè)置為以下水平：固定超聲溫度30 ℃，超聲時(shí)間70 min，堿濃度0.2 mol·L，液固比25∶1 (mL·g)，考察不同的超聲功率300、400、500、600、700 W對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響；固定超聲溫度30 ℃，超聲功率500 W，堿濃度0.2 mol·L，液固比25∶1 (mL·g)，考察不同超聲時(shí)間40、50、60、70、80 min對(duì)蛋白提取率的影響；固定超聲溫度30 ℃，超聲時(shí)間70 min，超聲功率500 W，堿濃度0.2 mol·L，考察不同的液固比15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 (mL·g)對(duì)蛋白提取率的影響；固定超聲溫度30 ℃，超聲時(shí)間70 min，超聲功率500 W，液固比25∶1 (mL·g)，考察不同的堿濃度0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol·L對(duì)蛋白提取率的影響。每組實(shí)驗(yàn)3次平行，結(jié)果依據(jù)SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較分析，得到顯著性因素。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

利用Design-Expert 10.0.3軟件中的Box-behnken design(BBD)設(shè)計(jì)原理采取合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)施相應(yīng)曲面法。超聲功率、液固比、超聲時(shí)間和堿濃度(由單因素實(shí)驗(yàn)確定)作為實(shí)驗(yàn)因素，-1、0、1分別代表各因素的三個(gè)水平，共設(shè)計(jì)出29組實(shí)驗(yàn)。以龍須菜蛋白提取率為響應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)水平因素見(jiàn)表1。

表1 因素水平編碼表

1.3 酶解產(chǎn)物的制備

稱(chēng)取一定質(zhì)量的龍須菜粗蛋白質(zhì)，以料液比為1∶50(g·mL)比例加入超純水，根據(jù)表2的實(shí)驗(yàn)條件調(diào)節(jié)pH和溫度，分別按3%的加酶量加入5種酶，水浴振蕩酶解4 h，酶解完成后煮沸滅酶20 min，冷卻，10 000 r·min，4 ℃下離心15 min，取上清液，即為龍須菜蛋白酶解液，冷凍干燥后得龍須菜酶解產(chǎn)物，-20 ℃下密封保存。

表2 龍須菜蛋白酶解條件

1.4 抗氧化活性測(cè)定

1.4.1 鐵離子還原能力(FRAP)

測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[12]，制備FRAP工作液，含0.3 mol·L醋酸鹽緩沖液(pH 3.6)、0.01 mol·L2，4，6-三吡啶-S-三嗪[TPTZ]、0.02 mol·LFeCl·6HO 10∶1∶1，現(xiàn)配現(xiàn)用。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)不同濃度的FeSO標(biāo)準(zhǔn)液(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L)與FRAP工作液反應(yīng)后測(cè)得的吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。所得回歸方程為=0232 3+0001 2，=0.996，線(xiàn)性良好。

在0.1 mL 2 mg·mL待測(cè)樣品中加入1.8 mL FRAP工作液，并用蒸餾水補(bǔ)足至5 mL，混勻，37 ℃下反應(yīng)30 min，593 nm處讀出吸光度。同時(shí)以0.1 mL蒸餾水作空白對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)3組平行。計(jì)算鐵離子還原能力。

1.4.2 DPPH自由基清除能力

測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[13]，將1 mL 2 mg·mL待測(cè)樣品與1 mL 100 μmol·LDPPH溶液(無(wú)水乙醇作為溶劑)混合均勻，暗室孵育30 min(室溫)。于517 nm處測(cè)得吸光度。所有實(shí)驗(yàn)3組平行。計(jì)算DPPH自由基清除活性。

1.4.3 ABTS自由基清除能力

測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[14]，14.8 mmol·LABTS和5.2 mmol·L過(guò)硫酸鉀1∶1混合并在黑暗條件下反應(yīng)12 h制備ABTS工作液。在734 nm處用無(wú)水乙醇稀釋上述制得的工作液以獲得1.1±0.02的吸光度。用50 μL 2 mg·mL待測(cè)樣品與950 μL ABTS試劑混合，黑暗條件下靜置2 h，并在734 nm處測(cè)量上清液的吸光度。所有實(shí)驗(yàn)3組平行。計(jì)算ABTS自由基清除活性。

1.5 基礎(chǔ)特性測(cè)定

1.5.1 氨基酸分析

精確稱(chēng)取龍須菜蛋白質(zhì)于密封瓶中，加入6 mol·LHCl，充氮?dú)夥馄浚?10 ℃下水解22 h，過(guò)膜，使用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析。色氨酸測(cè)定用5 mol·LNaOH，在110 ℃下堿解22 h后上機(jī)分析。氨基酸評(píng)分(AAS)依據(jù)FAO/WHO提出的人體必需氨基酸均衡模式進(jìn)行計(jì)算。化學(xué)評(píng)分(CS)依據(jù)中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所提出的雞蛋蛋白氨基酸評(píng)分模式分析計(jì)算。

1.5.2 傅里葉紅外光譜

取用適量龍須菜蛋白質(zhì)及酶解產(chǎn)物進(jìn)行壓片，將制備好的樣品KBr壓片在400～4 000 cm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

1.5.3 分子量的測(cè)定

采用高效體積排阻色譜法，色譜柱為T(mén)SK-GELG2000SWXL(7.8 mm×300 mm)，流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸的乙腈和0.1%三氟乙酸的雙蒸水，以0.5 mL·min的流速洗脫40 min。將還原性谷胱甘肽(307.3 u)、L-氧化型谷胱甘肽(612.63 u)、桿菌肽(1 422.69 u)、抑肽酶(6 511.83 u)、細(xì)胞色素C(12 400 u)，用流動(dòng)相溶解并配制成濃度為2 mg·mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在214 nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用IBM SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行單因素方差(One-way ANOVA)的顯著性差異分析， 通過(guò)LSD法進(jìn)行單因素多重比較分析。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，差異顯著水平設(shè)置為<0.05。采用Origin 2019b軟件制圖。利用Design-Expert 10.0.3軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的多元回歸擬合分析。紅外光譜掃描采用OMNIC軟件擬合制圖。

2 結(jié)果及分析

2.1 不同超聲條件對(duì)龍須菜蛋白提取率的影響

如圖1所示，在超聲功率小于500 W的條件下，超聲功率的增加會(huì)帶動(dòng)空化作用及機(jī)械作用的加強(qiáng)，使得分子運(yùn)動(dòng)加劇，龍須菜細(xì)胞壁被加速破壞，蛋白質(zhì)溶出加快，所以蛋白質(zhì)提取率迅速上升；在500 W時(shí)蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最大，隨后提取率下降可能是因?yàn)槌晱?qiáng)度過(guò)大產(chǎn)生大量的空化氣泡無(wú)法完全潰滅，空化效率減弱。由單因素方差分析，各處理組之間存在顯著性差異(<0.05，圖1-A)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用500 W。

當(dāng)超聲提取時(shí)間從40～70 min增加時(shí)，龍須菜蛋白質(zhì)提取率也在逐漸增加，70 min時(shí)的提取率最大。這是超聲時(shí)間的延長(zhǎng)促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶出，因此，增加了蛋白質(zhì)的提取率；當(dāng)提取時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)到大于70 min后，提取率出現(xiàn)了下降，這可能是由于超聲波將龍須菜細(xì)胞中的酶溶出，部分之前溶出的蛋白質(zhì)被酶降解，從而造成蛋白質(zhì)提取率下降。由單因素方差分析，各處理組之間存在顯著性差異(<0.05，圖1-B)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用70 min的超聲時(shí)間。

當(dāng)液固比從15∶1(mL·g)增加至25∶1(mL·g)，隨著溶劑的量逐漸加大，龍須菜蛋白質(zhì)提取率迅速增加，液固比為25∶1(mL·g)時(shí)蛋白質(zhì)的提取率最大。這是因?yàn)橐汗瘫戎饾u增加會(huì)讓溶液黏度變低，使分子擴(kuò)散速率加快，此時(shí)體系內(nèi)各物質(zhì)分散均勻，可以很好地促進(jìn)龍須菜蛋白質(zhì)的溶出。然而繼續(xù)增加溶劑的量，蛋白質(zhì)提取率出現(xiàn)了緩慢下降的趨勢(shì)，可能是由于內(nèi)容物的大量溶出導(dǎo)致溶液黏度升高，分子擴(kuò)散速率變緩，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率效果不理想。由單因素方差分析，各處理組之間存在顯著性差異(<0.05，圖1-C)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用25∶1(mL·g)的液固比。

隨著堿濃度增加，龍須菜蛋白提取率不斷增加，堿濃度為0.2 mol·L時(shí)的蛋白質(zhì)提取率最高。這是由于堿濃度的增加，龍須菜的致密結(jié)構(gòu)松散程度變大，同時(shí)促進(jìn)了氨基酸極性基團(tuán)的解離程度，使其表面具有同樣的電荷，增加溶出效果。另外蛋白質(zhì)分子上的氨根離子也會(huì)被電離，使游離蛋白質(zhì)增加，大多數(shù)水溶性蛋白的溶解程度也會(huì)加大。但是堿濃度偏高的情況下會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，分子內(nèi)部疏水性基團(tuán)被暴露，蛋白質(zhì)的溶解性降低，有蛋白沉淀生成(脫氨脫羧反應(yīng)的結(jié)果)，這也是堿濃度逐漸加大后蛋白質(zhì)提取率下降的原因。由單因素方差分析，各處理組之間存在顯著性差異(<0.05，圖1-D)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用0.2 mol·L的堿濃度。

點(diǎn)線(xiàn)圖上無(wú)相同小寫(xiě)字母的表示各處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與顯著性分析

以龍須菜蛋白提取率為值，堿濃度(A)、液固比(B)、超聲時(shí)間(C)、超聲功率(D)為自變量，根據(jù)Design-Expert 10.0.3軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析擬合后得出四元二次回歸模型方程

(%)=74.52-1.47A-2.19B+0.96C-1.01D+1.42AB+1.97AC-0.17AD+3.43BC+6.03BD-5.06CD-3.47A-6.33B-9.25C-7.21D。

表3 模型回歸方程方差分析

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化及工藝驗(yàn)證

經(jīng)Design-Expert 10.0.3軟件對(duì)堿濃度(A)、液固比(B)、超聲時(shí)間(C)、超聲功率(D)的交互作用進(jìn)行分析，得到響應(yīng)面3D圖及等高線(xiàn)圖，該圖組可反映各因素及其交互作用對(duì)龍須菜蛋白提取率的影響。具體如圖2-圖4所示。

圖2 液固比與超聲時(shí)間交互作用的響應(yīng)面3D圖及等高線(xiàn)圖

圖3 液固比與超聲功率交互作用的響應(yīng)面3D圖及等高線(xiàn)圖

圖4 超聲時(shí)間與超聲功率交互作用的響應(yīng)面3D圖及等高線(xiàn)圖

由Design-Expert 10.0.3軟件分析得到龍須菜蛋白質(zhì)的最優(yōu)提取工藝為堿濃度0.19 mol·L、液固比23.94∶1(mL·g)、超聲時(shí)間70.46 min、超聲功率482.22 W，此條件下的提取率預(yù)測(cè)值為75.14%。根據(jù)實(shí)際操作可行性，龍須菜蛋白提取工藝條件調(diào)整為堿濃度0.2 mol·L、液固比24∶1(mL·g)、超聲時(shí)間70 min、超聲功率482 W，3次平行試驗(yàn)后得到龍須菜蛋白提取率為(73.78±1.36)%，與理論值比較接近，表明此響應(yīng)面模型優(yōu)化得到的龍須菜蛋白提取工藝可靠，可將其應(yīng)用于實(shí)踐中。

2.3 龍須菜蛋白質(zhì)氨基酸分析

由表4可知，龍須菜蛋白質(zhì)中包含了人體所需的8種必需氨基酸。其中Glu、Cys含量較高，Asp、Leu的含量次之。必需氨基酸占比為36.71%，非必需氨基酸占比為63.29%，這與FAO/WHO理想氨基酸標(biāo)準(zhǔn)接近，表明龍須菜蛋白質(zhì)氨基酸組成合理。同時(shí)采用FAO/WHO聯(lián)合推薦的必需氨基酸模式和雞蛋蛋白模式評(píng)估蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。賴(lài)氨酸為第一限制性氨基酸。龍須菜蛋白質(zhì)中的Val、Met、Leu、Phe+Tyr、Ile、Thr均高于FAO/WHO氨基酸標(biāo)準(zhǔn)模式；Val、Leu、Phe+Tyr、Ile、Thr高于雞蛋蛋白氨基酸模式，表明龍須菜蛋白質(zhì)氨基酸組成符合人體需求模式，是一種理想植物蛋白源。

表4 龍須菜蛋白氨基酸組成及必需氨基酸分析

2.4 龍須菜蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物特性分析

2.4.1 抗氧化能力

龍須菜蛋白質(zhì)經(jīng)不同蛋白酶水解后其酶解產(chǎn)物抗氧化活性如圖5所示。由圖5可知，提取得到的龍須菜蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2 mg·mL時(shí)，其鐵離子還原能力(FRAP)、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清率分別為51.58 μg·mL、40.67%、50.10%。這與蔡苗苗等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近，其對(duì)超聲輔助水提法提取出的舌狀蜈蚣藻()粗蛋白質(zhì)進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，結(jié)果表明其還原力、DPPH自由基清除能力及 ABTS自由基清除能力均存在劑量依賴(lài)，證明藻類(lèi)蛋白具有一定抗氧化活性。龍須菜蛋白質(zhì)經(jīng)不同蛋白酶水解后，其抗氧化活性均有不同程度的提升。當(dāng)酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為2 mg·mL時(shí)，堿性蛋白酶的龍須菜酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和鐵離子還原能力(FRAP)均顯著高于其他4種蛋白酶的酶解產(chǎn)物和同濃度下的龍須菜蛋白質(zhì)。這與陳洪彬等對(duì)龍須菜多肽的體外抗氧化活性研究結(jié)果相近，表明龍須菜抗氧化肽具有一定清除DPPH自由基能力和還原力。酶解產(chǎn)物抗氧化活性的提高可能是由于大分子物質(zhì)在與自由基反應(yīng)時(shí)會(huì)存在較大的空間位阻，導(dǎo)致抗氧化活性低下。而經(jīng)進(jìn)一步酶解后，大分子蛋白質(zhì)在酶的作用下被剪切為更小的肽片段，能夠與自由基充分反應(yīng)。

酶種類(lèi)E1、E2、E3、E4、E5分別為木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、植物蛋白復(fù)合酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶，P表示龍須菜蛋白質(zhì)。柱狀圖上無(wú)相同小寫(xiě)字母的表示各處理間差異顯著(P <0.05)。

2.4.2 分子量分布分析

龍須菜蛋白質(zhì)不同酶解產(chǎn)物的分子量分布如表5所示。由表5可知，在龍須菜蛋白質(zhì)5種酶解產(chǎn)物中，分子量<1 500 u的組分占比均可達(dá)到50%以上，其中木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物其分子量>5 000 u的組分含量最多，而胃蛋白酶酶解產(chǎn)物<500 u的組分含量最多。Chai等的研究表明，大多數(shù)抗氧化肽的分子量在500～1 800 u，且通常認(rèn)為分子量較小的肽抗氧化活性較好。同時(shí)Aleman等的研究表明，酶解產(chǎn)物分子量過(guò)小可能會(huì)因含有大量的游離氨基酸而使其抗氧化活性降低。在龍須菜蛋白質(zhì)不同酶解產(chǎn)物中，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物其分子量在500～1 500 u組分含量均高于其他4種酶解產(chǎn)物，其酶解產(chǎn)物抗氧化活性也最高。

表5 酶解產(chǎn)物的分子量分布

2.5 傅里葉紅外光譜分析

龍須菜蛋白質(zhì)及其堿性蛋白酶酶解后產(chǎn)物的傅里葉紅外光譜見(jiàn)圖6。由圖6所示，酶解產(chǎn)物的圖譜相對(duì)于蛋白質(zhì)而言發(fā)生了一定遷移。兩種物質(zhì)的紅外光譜由酰胺A、B和酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶組成。酰胺A帶處于波長(zhǎng)3 300～3 340 cm，反映了N-H與O-H中氫鍵的伸縮振動(dòng)吸收。位于1 600～1 660 cm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的酰胺Ⅰ帶是C=O鍵的特征譜帶， 能夠有效地反映三螺旋結(jié)構(gòu)。酰胺Ⅰ帶對(duì)分子幾何結(jié)構(gòu)和氫鍵模式的微小變化非常敏感，因此每種類(lèi)型的二級(jí)結(jié)構(gòu)都會(huì)產(chǎn)生不同的C=O拉伸頻率。從圖譜中可以看出，龍須菜蛋白質(zhì)在1 645 cm有強(qiáng)烈的伸縮振動(dòng)，酶解產(chǎn)物則遷移到1 649 cm處發(fā)生伸縮振動(dòng)，表明蛋白質(zhì)具有更為完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。酰胺Ⅱ帶中1 530～1 510 cm區(qū)域與1 550～1 530 cm區(qū)域分別表明反平行β-折疊結(jié)構(gòu)與平行β-折疊結(jié)構(gòu)的存在，龍須菜蛋白質(zhì)在1 537 cm處具有吸收峰，表明龍須菜蛋白質(zhì)存在平行β-折疊結(jié)構(gòu)；酶解產(chǎn)物在1 511 cm處具有吸收峰，表明酶解產(chǎn)物有反平行β-折疊結(jié)構(gòu)存在。龍須菜蛋白質(zhì)在1 030 cm處產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸收峰，極可能是由于C-N鍵發(fā)生的伸縮振動(dòng)。紅外光譜分析初步表明，龍須菜蛋白質(zhì)經(jīng)堿性蛋白酶酶解后結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定變化，蛋白質(zhì)中完整的三螺旋結(jié)構(gòu)被水解破壞，平行β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉雌叫笑?折疊結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的變化可能會(huì)將蛋白質(zhì)中原本被緊密包裹的活性基團(tuán)暴露，使得酶解產(chǎn)物更易被自由基奪取電子，具備更好的抗氧化能力。

圖6 龍須菜蛋白與酶解產(chǎn)物紅外光譜掃描圖

3 結(jié)論

本研究以龍須菜為原料，采用超聲輔助堿提酸沉法制備龍須菜蛋白質(zhì)，在單因素實(shí)驗(yàn)的前提下，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)龍須菜蛋白質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了方程擬合度良好且顯著的響應(yīng)面模型。研究得到龍須菜蛋白質(zhì)的最佳提取工藝條件為堿濃度0.2 mol·L、液固比24∶1(mL·g)、超聲時(shí)間70 min、超聲功率482 W，實(shí)際提取率達(dá)到73.78%與理論值大致相近。對(duì)龍須菜蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸分析結(jié)果表明，龍須菜蛋白是一種優(yōu)質(zhì)理想的植物蛋白源。此外，分別采用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、植物蛋白復(fù)合酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)龍須菜蛋白質(zhì)進(jìn)行了酶解。該5種酶解產(chǎn)物在抗氧化活性和分子量分布上均呈現(xiàn)出一定差異?？偟膩?lái)說(shuō)，龍須菜蛋白酶解物的抗氧化活性均高于同濃度下的龍須菜蛋白，且堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性最高，其分子量主要集中在1 500 u以下。傅里葉紅外光譜掃描表明龍須菜蛋白與其酶解物具有不同結(jié)構(gòu)特性。本文可為龍須菜蛋白的提取及高值化利用提供一定參考。