許建軍，馬 燕，吳其超，王寶盛，臧德奎

(黃河下游國家林業(yè)局林業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山東 泰安 271018)

玫瑰()為薔薇科(Rosaceae)著名的香料和觀賞植物，玫瑰的野生種群(野生玫瑰)是觀賞和食用玫瑰育種的重要種質(zhì)。野生玫瑰除了具有極高觀賞價值、經(jīng)濟(jì)價值以及重要的藥用價值，它還作為一種優(yōu)良的海岸防風(fēng)固沙植物，對維持濱海生態(tài)環(huán)境具有重要意義，同時其獨(dú)特的分布模式對研究植物區(qū)系具有重要作用。但是這個極具研究和開發(fā)利用價值的物種，由于其濱海自然分布特點(diǎn)的適生環(huán)境受經(jīng)濟(jì)開發(fā)利用的嚴(yán)重影響，早在1992年野生玫瑰就被作為國家二級珍稀瀕危植物編入《中國植物紅皮書》。目前分布區(qū)域逐年縮小，呈現(xiàn)片段化，甚至部分區(qū)域已經(jīng)消失不見，急需得到保護(hù)。

葉綠體基因具有受到的選擇壓力小、單親遺傳、無重組等優(yōu)點(diǎn)，是研究譜系地理學(xué)的理想標(biāo)記，在種內(nèi)和種間研究中應(yīng)用較多。核基因ITS具有雙親遺傳、引物通用性強(qiáng)、堿基變異速率快等優(yōu)點(diǎn)，作為對cpDNA的完善和補(bǔ)充，其在譜系地理學(xué)研究中的應(yīng)用也逐步增多。二者結(jié)合在個體和群體水平上對物種祖先群體的探討、生物冰期避難所及冰期后物種重新擴(kuò)散等多個方面取得了重大發(fā)現(xiàn)。例如，利用葉綠體序列和核基因ITS序列聯(lián)合分析研究中國紅豆杉、文冠果、舟山新木姜子等植物的譜系地理。

近年來，國內(nèi)對于野生玫瑰的研究主要側(cè)重于栽培品種的開發(fā)應(yīng)用，對野生資源遺傳多樣性和保護(hù)利用逐漸涉及，然而針對野生玫瑰的譜系地理和系統(tǒng)發(fā)育的研究尚未開展。本研究以野生玫瑰8個種群的157個個體為試材，通過PCR擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物測序，從12對葉綠體基因組引物和4對核基因組ITS引物中篩選高多態(tài)性引物，分析了野生玫瑰種群的遺傳多樣性，并以此構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對所篩選引物進(jìn)行有效性驗證。為進(jìn)一步研究瀕危植物野生玫瑰的譜系地理和系統(tǒng)發(fā)育奠定基礎(chǔ)，為該珍稀瀕危物種的種群恢復(fù)及保護(hù)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究材料采自野生玫瑰自然分布區(qū)煙臺、威海、遼寧、吉林4個地區(qū)，采集生長良好、無病斑幼嫩葉片，用變色硅膠迅速脫水干燥，共8個野生種群的材料(表1)，帶回實(shí)驗室整理后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 野生玫瑰各種群的采樣信息

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與檢測

采用改良的CTAB法(增加水浴時間至1h，調(diào)整氯仿異戊醇的抽提次數(shù))提取野生玫瑰全基因組DNA。用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，拍照查看DNA的質(zhì)量。同時用核酸蛋白檢測儀檢測DNA的濃度與純度，按照儀器使用說明進(jìn)行。最后將原液DNA稀釋到40 ng·μL，放入冰箱-20 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增、測序及引物篩選

通過查閱文獻(xiàn)，將已經(jīng)發(fā)表的比較適合種內(nèi)水平的12對cpDNA引物(psbA-trnH、trnL-trnF、trnS-trnG、accD-psal、ndhF-rpl32、rpl20-rps12、atpF-atpH、rpl16、rbcl、psbJ-petA、psbD-trnT、trnV-trnW)(表2)和4對核基因ITS序列引物(ITS1、ITS2、ITS4、ITS5)(表2)交由擎科生物有限公司合成。用上述引物對24個DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增和測序，PCR反應(yīng)體系25 μL，包括1.1×T3 Super PCR MIX 22 μL、50 ng·μL模板DNA 1 μL、10 μmol·LForward Primer和10 μmol·LReverse Primer各1 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，退火10 s(退火溫度根據(jù)文獻(xiàn)確定)，72 ℃延伸(延伸時間根據(jù)10 kb·s計算)，35個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，篩選出條帶清晰明亮、無雜帶、僅一條特異性擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送到北京六合華大基因有限公司純化測序。

表2 cpDNA和ITS通用引物序列

將測序數(shù)據(jù)利用Chromas2.3軟件對所得堿基序列和原始峰圖進(jìn)行查看、比對和人工校正，然后將處理好的測序數(shù)據(jù)導(dǎo)入DNAMan軟件中，通過序列對比，記錄包括堿基的插入、缺失、倒置和替換等變異位點(diǎn)。

分別求出每對引物序列對應(yīng)樣品的核苷酸多態(tài)性(Π)和核苷酸差異平均數(shù)(K)，以此來判斷所選引物是否具有高變異率。

1.2.3 遺傳多樣性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

通過Permut軟件獲得野生玫瑰總體遺傳多樣性(Ht)和種群內(nèi)平均遺傳多樣性(Hs)；將調(diào)整好的測序數(shù)據(jù)分別輸入到Notepad軟件處理保存成fasta文件，導(dǎo)入launch DNASP6軟件中，運(yùn)行DNA Polymorphism程序獲得各種群的單倍型多態(tài)性Hd，即各種群的遺傳多樣性。

將處理好的測序數(shù)據(jù)保存為mega格式的文件，輸入MEGA7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。首先運(yùn)行Select Taxa and Groups程序?qū)?57個擴(kuò)增序列進(jìn)行8個種群分組，然后運(yùn)行Compute Net Between Group Mean Distances程序計算8個種群間的遺傳距離，最后利用Neighbor-Joining Tree程序進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量檢測

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，DNA條帶清晰無拖尾，點(diǎn)樣孔無亮條，說明未產(chǎn)生DNA降解和含有雜質(zhì)的現(xiàn)象；核酸蛋白檢測儀檢測結(jié)果表明，所提DNA濃度在1 542～3 880 ng·μL，/在1.7～1.9，/在1.8以上，均符合后續(xù)試驗條件。

2.2 PCR擴(kuò)增及引物篩選

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，trnL-trnF、trnS-trnG、rpl20-rps12、rpl16、rbcl五對葉綠體引物和ITS1、ITS2兩對核基因引物條帶清晰、單一，可作為候選引物，其余7對葉綠體引物和2對核基因ITS引物擴(kuò)增結(jié)果存在未出帶、非特異性擴(kuò)增的現(xiàn)象，不符合實(shí)驗要求。測序數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，trnS-trnG引物序列和ITS2引物擴(kuò)增產(chǎn)物序列中存在大量套峰；在通過DNAMAN軟件序列比對后，發(fā)現(xiàn)rpl16引物擴(kuò)增產(chǎn)物序列中無變異位點(diǎn)，不具有多態(tài)性；trnL-trnF、rpl20-rps12、rbcl、ITS1四對引物擴(kuò)增產(chǎn)物序列中具有不同程度的變異位點(diǎn)(表3)，有較高的多態(tài)性，能夠進(jìn)行野生玫瑰遺傳分化和譜系地理的研究。

表3 四對篩選序列在野生玫瑰群體中的變異位點(diǎn)分布

根據(jù)launch DNASP6軟件DNA Polymorphism程序?qū)С龅暮塑账岫鄳B(tài)性(Π)、核苷酸差異平均數(shù)(K)，繪制柱狀圖(圖1)進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)篩選出的3對變異豐富的cpDNA引物，按照擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸多態(tài)性(Π)值由高到低依次為rpl20-rps12、trnL-trnF、rbcl；按照擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸差異平均數(shù)(K)值高低依次為rpl20-rps12、rbcl、trnL-trnF。ITS1引物擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸多態(tài)性(Π)值為0.17，核苷酸差異平均數(shù)(K)值為0.43。

圖1 四對野生玫瑰引物擴(kuò)增產(chǎn)物的Π值和K值

2.3 遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用Dna SPv6軟件計算得到野生玫瑰整體遺傳多樣型較低，Ht=0.435，種群內(nèi)平均遺傳多樣性(Hs)為0.343。單倍型多態(tài)性(Hd)數(shù)值范圍結(jié)果所示：成山鎮(zhèn)(CSZ)種群多態(tài)性最高，遺傳多樣性最高；吉林九沙坪(JSP)、煙臺牟平高爾夫(GEF)、酒館村(JGC)、石城島(SCD)、威海大偉廣場(DWGC)種群遺傳多樣性次之，吉林沙丘公園(SQGY)、遼寧莊河花園口(HYK)多態(tài)性最低，種群遺傳多樣性最低。

在0.177～0.733。各種群的單倍型多態(tài)性如圖2

圖2 八個種群內(nèi)的單倍型多態(tài)性

基于3對葉綠體引物trnL-trnF、rpl20-rps12、rbcl擴(kuò)增測序聯(lián)合分析的結(jié)果，利用8個種群間的遺傳距離構(gòu)建野生玫瑰系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果顯示：野生玫瑰8個種群明顯分為2大支，吉林沙丘公園(SQGY)種群、九沙坪(JSP)種群為一支；遼寧莊河花園口(HYK)種群、石城島(SCD)種群、煙臺牟平高爾夫(GEF)、酒館村(JGC)、威海大偉廣場(DWGC)、成山鎮(zhèn)(CSZ)6個種群為另外一支。

橫線上方數(shù)字代表遺傳距離。

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗表明，在已發(fā)表的葉綠體DNA通用引物中，較少的引物適用于野生玫瑰譜系地理研究，這可能與物種的不同有關(guān)。有待獲得充足的野生玫瑰葉綠體基因組數(shù)據(jù)，尋找高多態(tài)性的片段，自主設(shè)計引物序列，更全面地用于野生玫瑰系統(tǒng)發(fā)育和譜系地理的研究。ITS(internal transcribed spacer)由內(nèi)間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)1、5.8S以及內(nèi)間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)2序列片段組成，總長度在660 bp左右，我們在野生玫瑰引物篩選實(shí)驗的測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，ITS1序列片段存在堿基突變與多態(tài)性位點(diǎn)，5.8S基因具有高度的保守性，序列沒有差異變化，而ITS2序列片段存在大量的堿基重復(fù)與高級結(jié)構(gòu)，無法進(jìn)行正常的序列堿基讀取，最終選取ITS1(長度在285 bp)作為核基因引物序列，適合研究野生玫瑰的譜系地理。

實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，野生玫瑰的種群變異率較低，意味著種群遺傳多樣性較低，這可能與葉綠體基因組自身進(jìn)化速率以及變異率相對較低而導(dǎo)致遺傳多樣性較低；同時野生玫瑰成熟果實(shí)的種子在經(jīng)過鳥類吞食消化以及長時間、長距離的飛行，即使能夠傳播也很難存活并生長成植株，加上有性生殖能力差的繁殖特點(diǎn)使得遠(yuǎn)距離種群間基因交流變得困難，造成種群遺傳分化程度升高，遺傳多樣性降低；另外與野生玫瑰分布區(qū)域范圍狹窄，相對集中，且呈片段化的分布特點(diǎn)有關(guān)，種群經(jīng)過長時間的遺傳漂變造成等位基因丟失，遺傳多樣性不斷降低。

基于遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果來看，8個野生玫瑰種群明顯分為2支，種群間的親緣關(guān)系與其地理位置的遠(yuǎn)近相關(guān)，地理距離較近的種群通常聚為一支，如煙臺酒館村(JGC)種群、高爾夫(GEF)種群、威海大偉廣場(DWGC)種群以及成山鎮(zhèn) (CSZ)種群地理距離較近，顯示其親緣關(guān)系較近；吉林琿春九沙坪(JSP)種群、吉林沙丘公園(SQGY)種群和煙臺、威海種群地理距離較遠(yuǎn)，限制了種子的傳播，阻斷了基因流，沒有聚為一支，其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。對于遼寧莊河市花園口(HYK)種群、石城島(SCD)種群和煙臺威海種群聚在一支的情況，馮立國等根據(jù)實(shí)驗結(jié)果推測野生玫瑰起源于山東東部沿海，后向北發(fā)展演化形成遼寧南部種群；Jiang等通過保守DNA衍生多態(tài)性(CDDP)分子標(biāo)記實(shí)驗研究不同種源的野生玫瑰遺傳分化，聚類分析將遼寧種群與煙臺威海種群聚在一起，均與本實(shí)驗得出的結(jié)論一致。同時在歷史上遼東半島與山東半島同屬膠遼古大陸，植物屬于同一區(qū)系，在后來的燕山事件和地殼運(yùn)動影響下，現(xiàn)今的渤海陸地開始下沉，海水進(jìn)入，遼東半島和山東半島才逐漸分開，另外由于物種的演化和變異是一個久遠(yuǎn)漫長的過程，種群之間基因變異較小，故親緣關(guān)系較近。

本研究共篩選出3對多態(tài)性較好的cpDNA引物(trnL-trnF、rpl20-rps12、rbcl)和1對核基因ITS引物(ITS1)，適用于研究野生玫瑰種內(nèi)的遺傳分化、系統(tǒng)發(fā)育和譜系地理結(jié)構(gòu)，能夠進(jìn)一步探究瀕危物種野生玫瑰的譜系地理。