夏煜琪，孫 宇，劉志鑫，孫瑞青，楊 楠，蒲金基，3，張 賀，3，*

(1.海南大學(xué) 植物保護學(xué)院 熱帶作物學(xué)院，海南 ?？?570228； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境與植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室，海南 ?？?571101； 3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?71101)

油菜素內(nèi)酯(Brassinosteroid)又稱蕓苔素內(nèi)酯，是植物特有的類固醇激素，最早于1968年由Marumo Shingo(丸茂晉吾)發(fā)現(xiàn)，活性高于生長素，可引起水稻第二葉卷曲，在發(fā)表后未引起注意；1970年，該物質(zhì)由Mitchell和他的助手首次從油菜花粉中篩選分離出來，并命名為油菜素(Brassins)。目前已發(fā)現(xiàn)60余種油菜素內(nèi)酯類化合物(Brassinosteroids)，廣泛分布于植物的各組織中，在未成熟的種子和花中含量最高，主要作用于植物的生長發(fā)育調(diào)控和應(yīng)激反應(yīng)過程，在改善作物農(nóng)藝性狀和增強植株的抗逆和抗病能力上發(fā)揮重要作用，包括提高作物產(chǎn)量與品質(zhì)，作用于單雙子葉植物在內(nèi)的高等植物先天免疫系統(tǒng)，又稱“逆境緩和激素”。2020年喻景權(quán)教授團隊研究揭示油菜素內(nèi)酯(BR)是解除番茄中頂端優(yōu)勢的關(guān)鍵信號，其通過整合激素和糖信號，促進側(cè)芽活化和側(cè)枝發(fā)生，為杧果改善株型、簡化栽培提供思路。BR信號通過與細胞膜上受體蛋白BRI1的胞外部分結(jié)合，可使BRI1胞內(nèi)部分與BAK1通過磷酸化作用相互激活，進而使BSUL發(fā)生磷酸化激活導(dǎo)致BIN2去磷酸化失活，解除對轉(zhuǎn)錄因子BES1/BZR1的抑制，最終使下游核心轉(zhuǎn)錄因子BES1/BZR1以非磷酸化的狀態(tài)積累，在細胞核中激活下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括與下游基因的E-box元件結(jié)合激活基因表達，與下游基因中的BR響應(yīng)元件BRRE-motif結(jié)合抑制基因的表達，進而調(diào)控植物的生長發(fā)育及其對生物脅迫和非生物脅迫等環(huán)境刺激的響應(yīng)。BES1是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，且只存在于陸生植物，與其同源蛋白BZR1高度相似。BES1的結(jié)構(gòu)域包括一個假定的NLS，隨后為一個高度保守的N端結(jié)構(gòu)域，多數(shù)成員含有能被BIN2等激酶磷酸化的絲氨酸富集位點，個別成員包含一個與蛋白穩(wěn)定性緊密相關(guān)的脯氨酸富集區(qū)，BES1轉(zhuǎn)錄因子的活性取決于它的磷酸化狀態(tài)，其N端與C端的結(jié)構(gòu)域是完成活動所必需的，特別是在促進細胞伸長上不可缺少。BES1在N端具有的bHLH結(jié)構(gòu)域可特異性結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)E框或BRRE元件，并與BIM1等轉(zhuǎn)錄因子配合，以調(diào)控BR誘導(dǎo)的基因。關(guān)于BES1功能的研究已有許多報道，在BR信號傳導(dǎo)中，BRs存在使BES1抑制HAT1和MYBL2的表達，BES1/BZR1具有多樣化的功能和作用機制，除介導(dǎo)BR信號，還參與ABA、GA及光等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而調(diào)控植物的生長發(fā)育以及抗凍、耐旱、耐鹽、抗病性等，關(guān)于BES1的降解機制也有報道，E3泛素連接酶SINATs可以和非磷酸化的BES1/BZR1互作，在光下直接介導(dǎo)BES1的泛素化降解。

目前針對BES1轉(zhuǎn)錄因子功能的深入研究，多以單子葉模式植物水稻、雙子葉模式植物擬南芥、大白菜等為主，研究發(fā)現(xiàn)，其在不同物種間的功能差異明顯，而對于漆樹科的典型的多年生木本果樹杧果()，BES1轉(zhuǎn)錄因子家族基因在抗病抗逆反應(yīng)中的作用機制尚未解析。生產(chǎn)中杧果常受到膠孢炭疽菌()、細菌性黑斑病菌(pv)等病菌的危害，需要選育抗病的新品種，從而適應(yīng)生產(chǎn)需求。Wang等、Li等完成的杧果全基因組測序工作，為通過全基因組層面分析基因功能提供了基礎(chǔ)型數(shù)據(jù)，本文對杧果轉(zhuǎn)錄因子BES1s家族進行生物信息學(xué)分析，對其理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)、病原菌和激素誘導(dǎo)表達等方面進行綜合分析，為進一步揭示其功能提供基礎(chǔ)資料，為杧果抗性種質(zhì)資源創(chuàng)制工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 杧果材料與病原菌侵染及激素處理

杧果苗來自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州市杧果種植資源圃，1年生貴妃杧，將杧果苗移栽到花盆種植，設(shè)置室溫25 ℃，相對濕度70%～90%，光周期12 h光照12 h黑暗，對新抽出嫩葉進行病害脅迫處理，使用濃度2×10mL的膠孢炭疽菌分生孢子懸浮液、2×10CFU·mL的細菌性黑斑病菌懸浮液、5 mmol ·mL茉莉酸甲酯溶液分別均勻噴霧，在0 、3 、6 、12 、24 、48 、72 h時剪取嫩葉片，3次重復(fù)。葉片液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組數(shù)據(jù)、蛋白序列來源

杧果全基因組數(shù)據(jù)來自NCBI(PRJNA487154)，番茄()、甘藍()、黃瓜()、辣椒()、擬南芥()和水稻()的基因組數(shù)據(jù)來自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，BES1蛋白序列信息來自PlantTFDB(http://planttfdb.gao-lab.org/)數(shù)據(jù)庫。

1.3 杧果BES1s基因家族成員的鑒定

從擬南芥數(shù)據(jù)庫獲取1家族成員蛋白序列，并將其作為查詢對象在杧果基因組數(shù)據(jù)庫中執(zhí)行Blastp比較，將E值設(shè)置為10，使用Pfam工具(http://pfam.xfam.org/)檢測得到最終所有杧果1基因家族成員。

1.4 杧果BES1s基因家族的生物信息分析

使用ProtParam在線分析工具(http//web.Expasy.org/protpasam/)預(yù)測氨基酸數(shù)、蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、等電點、穩(wěn)定性指數(shù)、親水性等理化性質(zhì)。在線軟件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)對杧果1基因家族的蛋白質(zhì)保守基序進行分析。在線工具SOPMA(https://www.expasy.org/)預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測基因的保守結(jié)構(gòu)域。SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測杧果BES1s家族成員蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

1.5 系統(tǒng)進化樹分析

利用MUSCLE程序?qū)x果和選出的6個物種中的BES1s基因家族成員的蛋白質(zhì)序列進行多序列比對。獲得BES1蛋白序列后使用MEGA 7.0軟件，通過鄰近法構(gòu)建進化樹，校驗參數(shù)Bootstrap值設(shè)置為1 000次重復(fù)。

1.6 cDNA合成

使用RNA prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取杧果葉片得總RNA，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得第1鏈cDNA，-80 ℃保存。

1.7 杧果BES1s基因家族表達分析

使用在線軟件Primer 3 plus(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)設(shè)計1基因家族成員引物，以上述處理杧果葉片cDNA為模板進行產(chǎn)物擴增。熒光試劑使用Ultra SYBR Mixture 試劑盒(北京康為世紀(jì))，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測系統(tǒng)Quant Studio 6 Flex，建立18 μL反應(yīng)體系，杧果作為內(nèi)參基因，0 h表達量作為對照，進行實時熒光定量PCR，獲得各樣品Ct值，運用2法計算樣品相對表達量，以大于1.5為上調(diào)表達、小于0.5為下調(diào)表達。

2 結(jié)果與分析

2.1 杧果BES1s家族成員理化性質(zhì)預(yù)測

通過生物信息學(xué)在線分析工具ProtParam(http:web.sxpasy.org/protparam/)對杧果BES1s家族13個成員氨基酸序列的理化性質(zhì)進行了分析(表1)，其中12個成員的氨基酸數(shù)為303～722、蛋白質(zhì)分子量為33.38～81.87 ku，MiBES1.8氨基酸個數(shù)為1 278，蛋白質(zhì)分子量142.67 ku，是家族成員中氨基酸個數(shù)和蛋白質(zhì)分子量最大的成員；蛋白質(zhì)呈酸性的成員有5個、等電點預(yù)測值介于5.6～6.59，呈堿性的成員有8個、等電點預(yù)測值介于7.57～9.20；13個成員的親水性系數(shù)均為負(fù)值，脂溶指數(shù)小于100，均屬于親水性蛋白；有12個成員的不穩(wěn)定系數(shù)大于40屬于不穩(wěn)定蛋白，僅MiBES1.1不穩(wěn)定系數(shù)為38.79屬于穩(wěn)定蛋白。

表1 杧果BES1s家族成員理化性質(zhì)預(yù)測

2.2 杧果BES1s家族成員蛋白系統(tǒng)進化樹

通過MEGA7.0軟件對杧果與番茄、辣椒、甘藍、擬南芥、黃瓜和水稻的1家族的蛋白質(zhì)序列進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示(圖1)，系統(tǒng)發(fā)育樹可分為5組(Class I～V)，依次包含1、5、2、2、3個成員。

BES1，杧果;Solyc，番茄;CA，辣椒;XP，甘藍;AT，擬南芥;Cucsa，黃瓜;LOC，水稻 。

18與茄科的番茄1家族的1個成員(Solyc10g04670)和辣椒1家族的1個成員(CA10g04670)親緣近，聚類在Class I組。1.1和1.2與十字花科甘藍(XP013613838.1)的親緣近，聚在一個小分支上；13、14和113與葫蘆科黃瓜(Cucsa.135490.2)親緣近，聚在一個小分支上，這5個成員聚類在Class Ⅱ組。1.12與葫蘆科的黃瓜(Cucsa.104900.2)和禾本科的水稻(LOC Os01g08180.1)親緣近，聚類在一個小分支上；1.9與茄科辣椒(CA04g01080)親緣近，聚在一個小分支上，這2個成員聚類在Class Ⅲ組。17和110與十字花科擬南芥(AT4G18890.1)和葫蘆科黃瓜(Cucsa.273670.1)親緣近，聚在一個小分支上，這2個成員聚類在Class Ⅳ組。111與禾本科水稻(LOC Os01g10610.1)親緣近，聚在一個小分支上；15和16與十字花科擬南芥(AT1G19350.5)親緣近，聚在一個小分支上，這3個成員聚類在Class Ⅴ組。

2.3 杧果BES1s家族成員結(jié)構(gòu)域預(yù)測

通過NCBI(CD-Search)對杧果1家族蛋白質(zhì)序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示(圖2)，13個成員均具有BES1_N結(jié)構(gòu)域，可以證明杧果1家族成員均屬于1轉(zhuǎn)錄因子，其中15、16、17、110、111、112的BES1_N結(jié)構(gòu)域歸類于基因家族BES1_N，18和19的BES1_N結(jié)構(gòu)域歸類于BES1_N基因超家族；11、12、13、14、113的BES1_N結(jié)構(gòu)域歸類于基因超家族AmyAc_family。

圖2 杧果BES1s家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

2.4 杧果BES1s家族系統(tǒng)進化及基因結(jié)構(gòu)

通過MEGA7.0軟件對杧果1家族成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過生物信息學(xué)在線分析工具MEME對杧果1家族成員保守基序預(yù)測，通過SOPMA在線工具對杧果1家族成員蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示(圖3),系統(tǒng)發(fā)育樹中13個成員分成3組，15、16、17、19、110、111聚在第1組(Ⅰ)；11、12、13、14和113聚在第2組(Ⅱ)；18聚在第3組(Ⅲ)?；蝾A(yù)測結(jié)果(圖3)顯示，13個成員均具有保守基序motif1，且有8個成員僅具有motif1保守基序，其中7個成員的motif1保守基序位于N端、1.8的motif1保守基序則位于C端；另5個成員11、12、13、14和113具有6個motifs，且位置相似。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖3)顯示，13個成員可分為3組，15、16、17、19、110、111屬于第Ⅰ組，主要元件包括α-螺旋(15.26%～20.46%)、β-轉(zhuǎn)角(4.29%～5.90%)、延伸連(7.26%～17.23%)和無規(guī)則卷曲(59.18%～72.39%)；11、12、13、14和113屬于第Ⅱ組，主要元件包括α-螺旋(32.75%～35.01%)、β-轉(zhuǎn)角(5.37%～6.31%)、延伸連(12.33%～14.15%)和無規(guī)則卷曲(45.77%～49.31%)；MiBES1.8屬于第Ⅲ組，主要元件包括α-螺旋(29.89%)、β-轉(zhuǎn)角(5.24%)、延伸連(15.02%)和無規(guī)則卷曲(49.84%)。

A，杧果BES1s家族成員系統(tǒng)發(fā)育樹；B，保守基序預(yù)測；C，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

通過DNA man工具對杧果BES1s家族成員均含有的唯一保守基序motif1進行多序列比對，結(jié)果顯示(圖4)，motif1具有50個氨基酸，杧果BES1s家族全部成員motif1的一致度為75.54%。

圖4 杧果BES1s家族成員motif 1多序列比對

2.5 杧果BES1s家族成員蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

通過SWISS-MODEL軟件基于同源建模原理，對杧果1家族蛋白三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示(圖5)，杧果1家族成員結(jié)構(gòu)模型預(yù)測可分為3組，這與杧果1家族成員二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果和蛋白序列的氨基酸組成一致，在模型預(yù)測中，以1Wdp.1為模型預(yù)測發(fā)現(xiàn)11、12、13、14、113具有類似的結(jié)構(gòu)特征，屬于第Ⅰ組；以5zd4.1為模型15、16、17、19、110、111、112具有類似的結(jié)構(gòu)，屬于第Ⅱ組；MiBES1.8同樣采用5zd4.1模型進行預(yù)測，結(jié)構(gòu)特征與第Ⅰ組和第Ⅱ組差異較大，屬于第Ⅲ組。

圖5 杧果BES1s家族成員蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.6 不同處理條件下杧果BES1s家族成員的表達

2.6.1 引物特異性鑒定結(jié)果

以杧果1家族成員的CDS序列，經(jīng)Primer 3 plus設(shè)計qRT-PCR引物，產(chǎn)物大小范圍介于153～337(表2)。瓊脂糖凝膠電泳法對引物特異性鑒定(圖6)發(fā)現(xiàn)，各對引物均能擴增出目的條帶，大小與預(yù)期結(jié)果一致，符合后續(xù)的實驗要求。

1-13， MiBES1.1-MiBES13; 14， Miactin; M， DL2 000 marker。

表2 qRT-PCR引物序列

2.6.2 膠孢炭疽菌侵染條件下杧果1基因家族成員的表達

通過qRT-PCR法測定杧果1基因家族成員在膠孢炭疽菌()侵染時的基因表達量，發(fā)現(xiàn)杧果1基因家族成員不同程度地響應(yīng)了膠孢炭疽菌的侵染過程(圖7-A)，1.1在侵染3～48 h過程中持續(xù)上調(diào)，1.5在侵染12～72 h過程中持續(xù)上調(diào)，1.6在侵染6和24 h時表達上調(diào)，1.8在侵染12 h顯著上調(diào)，1.9在侵染48～72 h顯著上調(diào)，1.10在侵染24 h表達上調(diào)；1.4在侵染3～6 h和48 h時表達下調(diào)，1.7在侵染3和12 h表達下調(diào)，1.12在侵染3～48 h過程中表達下調(diào)，1.13在侵染6～24 h過程中表達下調(diào)；1.3和1.11在侵染過程中表達無明顯變化。

“*”表示顯著上調(diào)，“#”表示顯著下調(diào)。A，膠孢炭疽菌侵染下杧果BES1s基因 家族成員相對表達分析; B，細菌性黑斑病菌侵染下杧果BES1s家族成員相對表達分析; C，施用茉莉酸甲酯條件下杧果BES1s家族成員相對表達分析。

2.6.3 細菌性黑斑病菌侵染條件下杧果1基因家族成員的表達

通過qRT-PCR法測定杧果1基因家族成員在細菌性黑斑病菌()侵染時的基因表達量，發(fā)現(xiàn)杧果1基因家族成員不同程度地響應(yīng)了細菌性黑斑病菌的侵染過程(圖7-B)，1.3和1.4在12～72 h侵染過程中上調(diào)表達，1.8在6～24 h侵染過程上調(diào)表達，1.9在6 h和24～48 h侵染過程中上調(diào)表達，1.13在12～72 h侵染時上調(diào)表達；1.7在侵染6和24 h時下調(diào)表達。整體上看，在侵染3 h時1.1～1.5和1.11表達下調(diào)，在侵染6 h時1.4、1.6、1.7和1.11～1.13表達下調(diào)；在侵染12 h時，除1.7和19外，其他成員全部上調(diào)表達，在侵染48 h時，1.3、1.4和1.9～1.13上調(diào)表達。

2.6.4 茉莉酸甲酯處理下杧果1基因家族成員的表達

通過qRT-PCR法測定的杧果1基因家族成員在噴施茉莉酸甲酯(MeJA)時的基因表達量，發(fā)現(xiàn)杧果1基因家族成員不同程度地響應(yīng)了茉莉酸甲酯的處理過程(圖7-C)，1.6和1.11在處理6 h過程中上調(diào)表達，1.13在處理3～6 h、24和72 h過程中上調(diào)表達；1.7、1.9和1.12在處理3～6 h下調(diào)表達；1.5在0～72 h處理過程中無明顯變化。整體上看，在處理48 h時，除1.5和1.11～1.13，其他成員均下調(diào)表達。

3 結(jié)論與討論

本文通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，杧果1家族成員均具有BES1_N結(jié)構(gòu)域，研究發(fā)現(xiàn)，BES1轉(zhuǎn)錄因子具有典型的BES1_N結(jié)構(gòu)域，證實篩選的杧果1家族成員均屬于BES1轉(zhuǎn)錄因子。MEME預(yù)測的保守基序、NCBI(CD-Search)預(yù)測的結(jié)構(gòu)域、SOPMA預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)、SWISS-MODEL預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)對比發(fā)現(xiàn)，13個杧果1家族成員可以分成3組，這與陳雪津等茶樹1家族成員分成3組的研究結(jié)果相同。杧果與其他6個物種的系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，18和19與茄科的辣椒、番茄親緣近；12、13、15～17和110則與十字花科的擬南芥和甘藍的親緣更近；13、14和113與葫蘆科黃瓜的親緣近；111與禾本科水稻親緣近；112則與葫蘆科黃瓜、禾本科水稻親緣近，組內(nèi)表現(xiàn)出相似性，組間差異較大，這與擬南芥的結(jié)果相似，AtBES1s不同成員間功能存在差異，推測杧果1家族成員與十字花科、茄科和葫蘆科植物中的BES1轉(zhuǎn)錄因子功能相同，而111的功能較其他成員出現(xiàn)分化，應(yīng)與水稻中的轉(zhuǎn)錄因子BES1功能相似，表明13個杧果BES1s家族成員功能存在差異，BES1轉(zhuǎn)錄因子在進化過程中在單雙子葉植物中出現(xiàn)分化。在結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析中，11～14和113具有BES1_N結(jié)構(gòu)域但歸類在基因超家族AmyAc，且三級結(jié)構(gòu)與其他成員差異較大，這與茶樹的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)成員不止具有BES1_N一種結(jié)構(gòu)域的結(jié)果相似，推測這5個成員還具有轉(zhuǎn)錄因子BES1外的功能。單子葉植物水稻的1家族成員在4組(Class Ⅱ～Ⅴ)中均有分布，但與杧果BES1s家族成員的親緣關(guān)系較遠，僅與111和112親緣近，推測其與水稻BES1轉(zhuǎn)錄因子功能有相似。在杧果1家族中有12個成員外顯子數(shù)目2～10個，與已報道的雙子葉植物茶樹、甘藍1基因家族分析一致，僅18有21個外顯子、20個內(nèi)含子，內(nèi)含子數(shù)目明顯多于其他成員，有研究表明，內(nèi)含子對于不同植物物種的進化很重要，根據(jù)杧果1家族結(jié)構(gòu)域的推測和系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，18與杧果1家族其他成員親緣關(guān)系比較遠，在結(jié)構(gòu)域預(yù)測中18和19歸類在1_基因超家族，推測缺少或具有不同于其他成員的功能，杧果1家族在功能上有一定分化。

在不同病原菌(真菌和細菌)侵染0～72 h過程中，杧果1家族成員均有不同程度的響應(yīng)。在侵染過程中1.1和1.5持續(xù)上調(diào)表達，1.12和1.13持續(xù)下調(diào)表達；在侵染過程中，侵染12 h時，除1.7和1.9外，其他成員均上調(diào)表達；推測在真菌和細菌侵染條件下，由不同成員發(fā)揮不同的作用增強植物抗病性，可將杧果BES1轉(zhuǎn)錄因子作為評價杧果抗病性的響應(yīng)基因。在茉莉酸甲酯(MeJA)處理0～72 h中，杧果1家族成員響應(yīng)基因與病原菌侵染中不同，施用MeJA過程中1.7、1.9和1.2持續(xù)下調(diào)表達；在處理48 h時除1.5和1.11～1.13，其他成員下調(diào)表達；茉莉酸(JA)及茉莉酸甲酯(MeJA)作為抗性激素在植物抵抗生物與非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用，還參與植物多個生長發(fā)育過程，而BR與JA存在拮抗作用，且在不同病原侵染時具有不同免疫機制，推測杧果1家族成員在BR與JA相互作用中發(fā)揮重要、不同作用，也有研究報道，1家族參與逆境脅迫響應(yīng)過程。下一步，將對本文所得到的響應(yīng)病原菌侵染、茉莉酸甲酯信號的杧果1家族成員，通過基因沉默、基因過表達等方式深入探討其在抗病抗逆中的作用機制，以及在植物生長發(fā)育中的功能。