馬琳莎　吳玉冰　范曉川　李菁　王焱煒　黃曉峰

〔摘要〕 目的 探索枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide）改善牙齦卟啉單胞菌來源脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）刺激下牙周膜干細胞的氧化應(yīng)激水平及炎癥因子的表達情況。方法 體外培養(yǎng)人牙周膜干細胞，分為對照組（不加LPS刺激，不加枸杞多糖處理）、炎癥組（10 μg /mL LPS）、實驗組（分為炎癥+50 μg/mL枸杞多糖組、炎癥+100 μg/mL枸杞多糖組、炎癥+200 μg/mL枸杞多糖組3個亞組，均采用10 μg/mL LPS刺激，之后分別添加50、100、200 μg/mL枸杞多糖處理）。CCK-8檢測細胞活性，熒光探針檢測活性氧水平，RT-PCR及Western blot檢測炎癥因子表達。結(jié)果 牙周膜干細胞在10 μg/mL LPS刺激下，增殖活力下降，活性氧水平及炎癥因子表達上調(diào);枸杞多糖能夠提升LPS刺激下的牙周膜干細胞增殖活性，且100 μg/mL與200 μg/mL（P<0.01）枸杞多糖較50 μg/mL（P<0.05）枸杞多糖提升更明顯;50 μg/mL枸杞多糖能下調(diào)LPS刺激下IL-1β基因表達（P<0.05）;100 μg/mL與200 μg/mL枸杞多糖能下調(diào)LPS刺激下活性氧水平（P<0.05），以及TNF、IL-1β基因（P<0.01）和蛋白表達水平（P<0.05）。結(jié)論 枸杞多糖能夠改善LPS刺激下牙周膜干細胞的活性，減輕活性氧水平及炎癥因子表達，保護牙周膜干細胞抗氧化潛能。

〔關(guān)鍵詞〕 枸杞多糖;脂多糖;牙周膜干細胞;氧化應(yīng)激;炎癥因子

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.05.013

Effect of Lycium barbarum polysaccharide on oxidative stress and inflammatory factors

expression of periodontal ligament stem cells under lipopolysaccharide stimulation

MA Linsha1， WU Yubing2， FAN Xiaochuan1， LI Jing1， WANG Yanwei1， HUANG Xiaofeng1*

（1. Department of Stomatology， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University， Beijing 100050， China; 2. Division of Development Planning and Hospital Management， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the influence of Lycium barbarum polysaccharide （LBP） on the oxidative stress and inflammatory factors expression of periodontal ligament stem cells stimulated by lipopolysaccharide （LPS） derived from porphyromonas gingivalis. Methods Periodontal ligament stem cells were obtained and cultured in vitro， and divided into control group （no LPS stimulation， no LBP treatment）， inflammatory group （10 μg/mL LPS） and experimental group （divided into three subgroups of inflammation+50 μg/mL LBP group， inflammation+100 μg/mL LBP group， inflammation+200 μg/mL LBP group， all were treated with 10 μ g/mL LPS stimulation， followed by 50， 100， 200 μg/mL LBP treatment）. CCK-8 was conducted to evaluate cell viability. The fluorescent probe was used to detect reactive oxygen species. The inflammatory factors expression was measured by RT-PCR and Western blot. Results The viability of periodontal ligament stem cells was decreased and the expression of reactive oxygen species and inflammatory factors increased under 10 μg/mL LPS stimulation; LBP could enhance the proliferation activity of LPS-stimulated periodontal ligament stem cells， and 100 μg/mL and 200 μg/mL （P<0.01） LBP increased more obviously than 50 μg/mL （P<0.05） LBP; 50 μg/mL LBP could down-regulate IL-1β gene expression under LPS stimulation （P<0.05）; 100 μg/mL and 200 μg/mL LBP could down-regulate the level of reactive oxygen species （P<0.05）， TNF， IL-1β gene （P<0.01） and protein expression （P<0.05） under LPS stimulation. Conclusion LBP can improve the viability of LPS-stimulated periodontal ligament stem cells and alleviated the reactive oxygen species level and inflammatory factors expression， and protect the antioxidant potential of periodontal ligament stem cells.0D79B62C-9DB2-4857-A4C1-F7BF93609B3A

〔Keywords〕 Lycium barbarum polysaccharide; lipopolysaccharide; periodontal ligament stem cell; oxidative stress; inflammatory factors

牙周炎是牙菌斑堆積所致慢性感染性疾病，伴隨牙齦卟啉單胞菌來源脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等毒力因子作用于局部，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，損害細胞功能，并最終導(dǎo)致牙槽骨喪失，牙松動脫落[1]。牙周膜干細胞是來源于牙周組織的間充質(zhì)干細胞，具有自我更新、多向分化及免疫調(diào)節(jié)潛能，在組織再生及牙周病治療領(lǐng)域研究頗多[2-3]。然而，在炎癥環(huán)境下，牙周膜干細胞的生物學功能出現(xiàn)損傷，因此，減輕炎癥刺激對干細胞的損傷具有實際意義[4]。

枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide）提取自中藥枸杞子，枸杞多糖中含有多種活性成分，包括多肽、多聚糖等，在抗衰老、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)方面具有重要價值，近年來受到廣泛關(guān)注[5-6]。而枸杞多糖是否能改善毒力因子LPS刺激下牙周膜干細胞的生物學功能，尚未見報道。因此，本研究以牙周膜干細胞為對象，LPS構(gòu)建體外炎癥環(huán)境，從枸杞多糖抗氧化潛在功效的角度，探索枸杞多糖對牙周膜干細胞的保護作用及炎癥因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 細胞? 牙周膜干細胞取自北京友誼醫(yī)院口腔科因正畸需要拔除前磨牙的患者，年齡18～28歲，拔牙術(shù)前簽署知情同意，本實驗經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院生命倫理委員會批準（批號21-2019）。本研究中細胞來自符合納入標準志愿者6人（男女各3人），每項實驗均進行生物學重復(fù)及技術(shù)重復(fù)。志愿者納入標準：18～28歲青年男女，自愿參與此項研究，因正畸需要而拔除前磨牙，無牙體、牙周疾病，無全身系統(tǒng)性疾病，無遺傳性疾病;排除標準：不符合納入標準者。

1.1.2? 試劑? 枸杞多糖標準品（批號：P7850）購自北京索萊寶科技有限公司;牙齦卟啉單胞菌來源脂多糖（批號：SMB00610）購自美國Sigma公司;a-MEM培養(yǎng)基（批號：12571071）、胎牛血清（批號：10100147）及0.25%胰酶（批號：25200072）購自美國Gibco公司;增強型CCK-8試劑盒（批號：C0041）、活性氧檢測試劑盒（批號：S0033S）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;細胞總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR試劑盒購自北京天根生物科技有限公司;Western blot試劑購自美國賽默飛世爾科技公司及美國CST公司。

1.2? 方法

1.2.1? 實驗分組? 本研究分為對照組（正常條件培養(yǎng)細胞）、炎癥組（添加10 μg/mL LPS構(gòu)建炎癥刺激）及實驗組[添加10 μg /mL LPS構(gòu)建炎癥刺激后12 h添加不同濃度枸杞多糖培養(yǎng)后檢測，根據(jù)枸杞多糖濃度（分別為50、100、200 μg/mL枸杞多糖）不同，再分3個實驗亞組：炎癥+50 μg/mL枸杞多糖組、炎癥+100 μg/mL枸杞多糖組、炎癥+200 μg/mL枸杞多糖組]。

1.2.2? 牙周膜干細胞原代培養(yǎng)? 采用酶消化法培養(yǎng)牙周膜干細胞，取前磨牙牙根中三分之一段牙周膜組織，在無菌EP管中剪碎，配置Ⅰ型膠原酶3 mg/mL，37 ℃搖床消化40 min，而后加入a-MEM終止消化，1000 r/min離心5 min（離心半徑：20 cm），棄上清，含15%胎牛血清的a-MEM重懸，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約5 d后觀察細胞貼壁后換液，之后每隔3 d換液，細胞融合達到培養(yǎng)皿80%，0.25%胰酶消化，采用免疫磁柱分選STRO-1陽性細胞，繼續(xù)傳代培養(yǎng)，采用第4代細胞進行實驗。

1.2.3? 細胞活性檢測? 細胞以103/孔接種于96孔板，貼壁后添加10 μg/mL LPS，12 h后分別添加50、100、200 μg/mL枸杞多糖，再過12 h后每孔加入10 μL增強型CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，采用酶標儀在450 nm測定吸光度，每組3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.4? 細胞活性氧水平檢測? 細胞以104/孔均勻接種于12孔板，貼壁后添加10 μg/mL LPS，12 h后添加50、100、200 μg/mL枸杞多糖，再過12 h后采用DCFH-DA熒光探針原位裝載于培養(yǎng)板中的細胞，無血清培養(yǎng)基清洗后，每孔加入DCFH-DA熒光探針，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，無血清培養(yǎng)基清洗3遍，倒置熒光顯微鏡下拍攝，并通過Image-Pro Plus 6.0進行熒光強度的定量分析。

1.2.5? 細胞炎癥因子基因表達? 細胞以105/孔均勻接種于6孔板，貼壁后添加10 μg/mL LPS，12 h后添加50、100、200 μg/mL枸杞多糖，再過12 h后采用試劑盒提取細胞總RNA，測定RNA濃度后，經(jīng)過42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，而后進行Real-time PCR，以GAPDH為內(nèi)參基因。PubMed Gene及Primer bank用于引物設(shè)計，Primer blast用于引物序列驗證，引物序列見表1。

1.2.6? 細胞炎癥因子蛋白表達? 細胞以105/孔均勻接種于6孔板，貼壁后添加10 μg/mL LPS，12 h后添加50、100、200 μg/mL枸杞多糖，再過12 h后采用RIPA裂解液（添加1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑）處理細胞，刮刀收集并超聲振蕩提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液100 ℃變性5 min，配制10% SDS-PAGE凝膠，取40 μg蛋白上樣，電泳分離，切膠轉(zhuǎn)PVDF膜（濕轉(zhuǎn)，220 mA，60 min），5% BSA溶液封閉，洗膜，一抗（1∶1000）4 ℃過夜，GAPDH為內(nèi)參蛋白，TBST洗膜，二抗（1∶5000）室溫2 h，TBST洗膜，加入ECL發(fā)光液，曝光拍照，ImageJ軟件分析條帶。0D79B62C-9DB2-4857-A4C1-F7BF93609B3A

1.3? 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，使用Shapiro-Wilk法進行正態(tài)性檢驗，數(shù)據(jù)符合正態(tài)性，采用單因素方差分析比較組間差異。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1? 枸杞多糖對LPS刺激下牙周膜干細胞活性的影響

體外培養(yǎng)約5 d后，可見細胞貼壁生長，呈梭形或纖維條狀，見圖1A。細胞分選后傳代培養(yǎng)，采用第4代進行實驗研究，見圖1B。采用CCK-8進行細胞活性評估，發(fā)現(xiàn)10 μg/mL LPS能夠抑制細胞活性，炎癥組與對照組差異具有明顯統(tǒng)計學意義（P<0.01），而添加枸杞多糖均能夠緩解LPS對牙周膜干細胞增殖活性的抑制作用，50 μg/mL枸杞多糖組牙周膜干細胞增殖活性強于對照組（P<0.05），并且100 μg/mL與200 μg/mL枸杞多糖組提升牙周膜干細胞增殖活性更明顯（P<0.01）。詳見圖2。

2.2? 枸杞多糖對LPS刺激下牙周膜干細胞活性氧水平的影響

10 μg/mL LPS能明顯促使細胞活性氧水平上升，與對照組相比差異具有明顯統(tǒng)計學意義（P<0.01）;添加50 μg/mL枸杞多糖，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;100 μg/mL枸杞多糖與200 μg/mL枸杞多糖均能有效減少LPS刺激下牙周膜干細胞的活性氧水平（P<0.05）。詳見圖3。

2.3? 枸杞多糖對牙周膜干細胞炎癥水平的影響

在10 μg/mL LPS刺激下，牙周膜干細胞TNF、IL-1β、IL-6基因表達均顯著上調(diào)（P<0.05）;50 μg/mL枸杞多糖能夠部分下調(diào)IL-1β的基因表達（P<0.05）;100 μg/mL與200 μg/mL枸杞多糖能夠明顯下調(diào)TNF及IL-1β的基因表達（P<0.01）。其中IL-6未見明顯改變（P>0.05）。100 μg/mL與200 μg/mL枸杞多糖均能下調(diào)TNF及IL-1β蛋白表達水平（P<0.05）。詳見圖4。

3 討論

枸杞是養(yǎng)生常用保健食品，枸杞經(jīng)過提煉所得產(chǎn)物枸杞多糖是一種大分子水溶性多糖，由甘露糖、木糖等6種單糖構(gòu)成的蛋白多糖，近年受到中西醫(yī)研究者的關(guān)注[7]，多項研究顯示枸杞多糖具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤等藥理作用[8-11]。有研究報道，枸杞多糖能夠抑制NK-kB信號通路保護人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖活性及其分泌功能，另有學者發(fā)現(xiàn)枸杞多糖通過下調(diào)人視網(wǎng)膜上皮細胞內(nèi)炎性因子IL-1β、MCP-1及NK-kB/MAPK通路阻止LPS誘導(dǎo)的細胞炎性反應(yīng)，并抑制高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的增殖和VEGF表達[12-14]。研究認為枸杞多糖發(fā)揮抗氧化作用的機制主要包括：清除超氧陰離子自由基及羥基自由基，激活Nrf2抗氧化通路，增強超氧化物歧化酶SOD的活性，調(diào)控凋亡途徑，減輕氧化應(yīng)激損傷[15-16]。

牙周膜干細胞是來源于牙周組織的間充質(zhì)干細胞，對牙周組織微環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持及牙周健康至關(guān)重要，臨床獲取較容易，并具有較強增殖活性、多向分化能力、免疫調(diào)節(jié)能力，因此，在口腔組織再生及牙周疾病治療方面有較好的應(yīng)用前景[17-18]。然而干細胞在局部微環(huán)境中，面臨多種來自細菌自身或代謝產(chǎn)生的毒性產(chǎn)物，對干細胞的活性及功能造成損傷。LPS來自革蘭氏陰性菌細胞壁成分，通過細胞表面Toll樣受體，激活下游炎癥通路，通過激活NF-kB和IRF途徑，促使與炎癥相關(guān)基因啟動子或增強子結(jié)合，啟動炎癥因子包括TNF、IL-1β、IL-6等多效性促炎細胞因子的表達，進一步激活iNOS，而炎癥因子會誘發(fā)ROS聚集，從而破壞細胞及微環(huán)境穩(wěn)態(tài)[19-21]。低水平ROS起調(diào)節(jié)細胞信號作用，而過量ROS則會是引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致DNA損傷，如DNA突變、缺失、斷裂等致命遺傳效應(yīng);導(dǎo)致生物膜脂質(zhì)過氧化，從而生成異常代謝物;導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，損傷細胞功能，細胞出現(xiàn)生長抑制、凋亡、自噬、壞死等[22-23]。因此，本研究亦選擇檢測炎癥因子TNF、IL-1β、IL-6的基因及蛋白表達水平，從而初步探索枸杞多糖改善炎癥刺激下牙周膜干細胞抗氧化的機制。而枸杞多糖通過何種途徑改善牙周膜細胞抗氧化及維護細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，以及炎癥通路與抗氧化系統(tǒng)的內(nèi)在聯(lián)系，有待后續(xù)研究進一步闡明。

目前，眾多研究圍繞調(diào)控牙周膜干細胞的藥物及作用機制，以對抗炎癥環(huán)境下牙周膜干細胞受損的生物學功能，而枸杞多糖對牙周膜干細胞的作用尚無報道，本實驗結(jié)果表明，枸杞多糖能夠增強LPS刺激下牙周膜干細胞的活性，下調(diào)炎癥因子TNF、IL-1β基因表達，減輕胞內(nèi)ROS水平，并發(fā)現(xiàn)這一作用與枸杞多糖的濃度呈現(xiàn)一定劑量效應(yīng)關(guān)系，為后續(xù)研究枸杞多糖對牙周膜干細胞生物學功能的作用及深入探索機制奠定了基礎(chǔ);另一方面，枸杞是保健食品，咀嚼枸杞能否對牙周組織炎癥有直接作用，尚未見報道。此外，枸杞多糖成分與藥效，還與不同產(chǎn)地及品種的枸杞，以及不同提取過程有重要關(guān)系。

綜上，通過本實驗發(fā)現(xiàn)枸杞多糖能夠維護牙周膜干細胞的增殖活性，通過下調(diào)炎癥基因的表達緩解氧化應(yīng)激損傷，提示枸杞多糖對牙周膜干細胞的保護作用，而枸杞多糖發(fā)揮作用的具體組分及機制仍有待進一步驗證，同時本研究也為枸杞多糖用于口腔疾病的治療帶來了啟發(fā)。

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（本文編輯? 蘇? 維）0D79B62C-9DB2-4857-A4C1-F7BF93609B3A