李益亮　姚金龍　梁爽　孫紹裘

〔摘要〕 目的 觀察桃紅四物湯對兔膝關節(jié)軟骨損傷模型noggin蛋白表達的影響，探討桃紅四物湯對兔膝關節(jié)軟骨損傷修復的分子作用機制。方法 從40只新西蘭兔中隨機挑選10只為假手術組，其余新西蘭兔根據(jù)改良Hulth法進行右膝關節(jié)軟骨損傷造模后，隨機分為模型組、桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組，每組10只。假手術組做同樣切口切至軟骨面，但不予以造模而直接縫合。術后各組分別以等量蒸餾水、桃紅四物湯、氨基葡萄糖進行灌胃。干預4、6周后，每組隨機抽取5只新西蘭兔，麻醉后進行腹主動脈采血，并循原手術切口暴露軟骨，大體觀察后截取包含股骨下端在內的軟骨關節(jié)面，采用ELISA法檢測noggin蛋白表達量;Western blot檢測軟骨組織中noggin的蛋白表達水平，并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。結果 干預4、6周后，桃紅四物湯組noggin蛋白的表達均低于模型組，高于假手術組（P<0.05）;與氨基葡萄糖組比較，桃紅四物湯組noggin蛋白的表達更低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。干預6周后，模型組、桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組關節(jié)面均不平整，但桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組軟骨修復情況優(yōu)于模型組。結論 桃紅四物湯能抑制noggin蛋白的表達，促進膝關節(jié)軟骨修復，且抑制noggin蛋白表達的效果較氨基葡萄糖更優(yōu)。

〔關鍵詞〕 軟骨損傷修復;桃紅四物湯;氨基葡萄糖;noggin蛋白;新西蘭兔

〔中圖分類號〕R274.9? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.05.004

Effect of Taohong Siwu Decoction on noggin protein expression in rabbit cartilage injury model： Study on the academic thoughts and clinical experience of famous orthopaedic teacher Sun Dawu （4）

LI Yiliang YAO Jinlong LIANG Shuang SUN Shaoqiu

（1. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Taohong Siwu Decoction on the expression of noggin protein in a rabbit knee cartilage injury model， and to explore the molecular mechanism of Taohong Siwu Decoction on the repair of knee cartilage injury in rabbits. Methods 10 New Zealand rabbits were randomly selected from 40 New Zealand rabbits as the sham operation group. The remaining New Zealand rabbits were randomly divided into model group， Taohong Siwu Decoction group and glucosamine group， with 10 rabbits in each group， after the right knee articular cartilage injury model was established according to the modified Hulth method. In the sham operation group， the same incision was made to cut to the cartilage surface， but it was directly sutured without modeling. After operation， each group was given the same amount of distilled water， Taohong Siwu Decoction and glucosamine by gavage respectively. After 4 and 6 weeks of intervention， 5 New Zealand rabbits were randomly selected from each group. After anesthesia， abdominal aortic blood was collected， and the cartilage was exposed through the original surgical incision. After gross observation， the cartilage articular surface including the lower end of the femur was cut， ELISA was used to detect noggin protein expression; Western blot was used to detect noggin protein expression in cartilage tissue， and statistical analysis of the data was performed. Results After 4 and 6 weeks of intervention， the expression of noggin protein in the Taohong Siwu Decoction group was lower than that in the model group and higher than that in the sham operation group （P<0.05）. Compared with the glucosamine group， the expression of noggin protein in the Taohong Siwu Decoction group was lower， the difference was statistically significant （P<0.05）. After 6 weeks of intervention， the articular surfaces of the model group， Taohong Siwu Decoction group and glucosamine group were all uneven， but the cartilage repair in the Taohong Siwu Decoction group and the glucosamine group was better than that in the model group. Conclusion Taohong Siwu Decoction can inhibit the expression of noggin protein and promote the repair of knee articular cartilage， and the effect of inhibiting the expression of noggin protein is better than that of glucosamine.

〔Keywords〕 cartilage damage repair; Taohong Siwu Decoction; glucosamine; noggin protein; New Zealand rabbit

外傷、疾病、遺傳等都能導致關節(jié)軟骨的損傷，且涉及各個年齡段，病程長[1]。膝關節(jié)軟骨損傷晚期往往會導致患者退行性關節(jié)炎的發(fā)生，造成患者行走困難，甚至出現(xiàn)夜間靜息痛，嚴重影響患者的生活質量。由于膝關節(jié)軟骨結構精密復雜，周圍局部血運不佳，因此，缺損后往往出現(xiàn)預后不佳，甚至難以治療的情況。目前，膝關節(jié)軟骨損傷多以手術治療為主，但是手術治療創(chuàng)傷大、費用昂貴，并且容易出現(xiàn)傷口感染、內固定松動等并發(fā)癥[2]。中醫(yī)學治療骨病歷史悠久，其優(yōu)勢在于無創(chuàng)、不良反應少、多靶點綜合治療等[3-4]。中醫(yī)學認為，軟骨損傷是由于局部外傷或某種原因導致的瘀阻不通，而引起經(jīng)脈、氣血不暢，最終導致局部軟骨營養(yǎng)供應缺失而造成軟骨損傷和愈合困難，從而引起一系列病變[5]。桃紅四物湯是國家級名中醫(yī)孫達武治療膝關節(jié)軟骨損傷的常用方劑，為治療氣滯血瘀型軟骨損傷的經(jīng)典方劑，具有補血活血、化瘀生新的功效[6]。多項研究表明，桃紅四物湯的活性成分，如阿魏酸、山柰酚、槲皮素、丹皮酚和咖啡酸，通過作用TNF、IL-17、MAPK、VEGF等信號通路，能夠有效地促進軟骨修復[7-8]。noggin信號通路與軟骨修復密切相關[9]，本研究采用桃紅四物湯干預新西蘭兔膝關節(jié)軟骨損傷模型，運用現(xiàn)代分子生物學檢測技術，探討桃紅四物湯對noggin信號通路中基因蛋白表達的影響，以期闡明桃紅四物湯治療膝關節(jié)軟骨損傷的分子機制，為中醫(yī)藥治療膝關節(jié)軟骨損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 動物與分組

選取40只新西蘭兔，SPF級、10月齡、雌雄各半，體質量（2.5±0.5） kg，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心統(tǒng)一購買，實驗動物許可證：SCXK（湘）2020-0005，動物實驗倫理審批號：LL2020061001。適應性飼養(yǎng)1周后，將40只新西蘭兔隨機挑選10只為假手術組，其余新西蘭兔進行右膝關節(jié)軟骨損傷造模后，隨機分為模型組、桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組，每組10只。

1.2? 藥物與試劑

桃紅四物湯藥物與劑量參照《醫(yī)宗金鑒》[10]：桃仁20 g，川芎10 g，當歸20 g，紅花10 g，赤芍20 g，生地黃20 g。中藥材由湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院購入并代煎，制成4 g/mL湯劑。桃紅四物湯灌胃劑量根據(jù)人與動物體表面積換算公式，予以4.7 g/kg灌胃。氨基葡萄糖：選用鹽酸氨基葡萄糖片（江蘇正大清江制藥有限公司，0.75 g×30片，批號：202046852）。

1.3? 主要儀器

實驗儀器搖床（江蘇其林貝爾有限公司，型號：TS-1）;電泳儀（型號：DYY-6C）、電泳槽（型號：DYCZ-24DN）、轉膜儀（型號：DYCZ-40D）均購于北京六一生物科技有限公司;磁力攪拌器（上海儀電科學儀器股份有限公司，型號：JB-13）;電子天平（美國雙杰有限公司，型號：JJ224BC）;生物樣品均質儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號：BioPrep-24）;臺式冷凍離心機（湖南湘儀有限公司，型號：H1650R）;旋渦混合器（江蘇其林貝爾有限公司，型號：GL-88B）。

1.4? 造模

新西蘭兔禁食、禁水6 h后，備好手術器械，做好術前準備。每只新西蘭兔稱重后，抽取1%戊巴比妥鈉0.02 mL/100 g對其進行腹腔麻醉。麻醉滿意后進行實驗。將新西蘭兔置于仰臥位，固定牢靠，充分顯露術野。備皮、消毒后，造模組（桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組、模型組）采用改良Hulth法[11]從膝關節(jié)內側，以髕骨內側緣為切口切開膝關節(jié)，依次切開皮膚、分離皮下筋膜，切除內側半月板，并且離斷前交叉韌帶，暴露股骨內側髁、關節(jié)腔、關節(jié)軟骨。部分軟骨損傷用刀片刮蹭軟骨表面，以軟骨表面粗糙，出現(xiàn)顆粒樣質感為造模成功。全層軟骨損傷以4 mm鉆頭在股骨內側髁鉆出一個深3.0～4.0 mm的創(chuàng)口，可隱約見松質骨，即為造模成功，清洗并逐層縫合傷口。假手術組以相同的手術入路進入關節(jié)腔，但是不進行造模。術畢，用過氧化氫溶液、生理鹽水、聚維酮碘交替沖洗關節(jié)腔，對關節(jié)囊、皮下筋膜組織嚴密縫合，最后縫合皮膚，術后連續(xù)3 d使用青霉素抗感染治療。

1.5? 干預方法

造模1周后，根據(jù)人與兔等效劑量換算公式[12]，桃紅四物湯組每日予以4.7 g/kg灌胃，氨基葡萄糖組每日予以70 mg/kg灌胃。稱取體質量的相應劑量，均予以蒸餾水稀釋配制成10 mL后進行灌胃。模型組、假手術組均予以等劑量的蒸餾水進行灌胃。1次/d，連續(xù)給藥4周后，各組隨機選取5只新西蘭兔進行實驗取材，剩余新西蘭兔連續(xù)灌胃6周后，進行取材。

1.6? 取材

最后一次給藥后第2天，使用1%戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉，處死新西蘭兔。抽取兔腹主動脈血，靜置離心后置于-20 ℃冰箱中保存;再于原手術入路切開關節(jié)囊，暴露股骨下端軟骨，大體上觀察軟骨缺損以及修復狀況以后，切取股骨下端軟骨標本，置于4%多聚甲醛中固定。

1.7? 指標檢測

1.7.1? ELISA法檢測軟骨組織中noggin蛋白表達量? 參照ELISA說明書，先設置各個不同濃度的標準品50 μL，并且設置空白孔和待測品孔。在待測品孔中加入40 μL稀釋液，再加入10 μL待測品（5倍稀釋濃度）。經(jīng)加酶、溫浴、配液、洗滌后加入顯色劑A 50 μL、顯色劑B 50 μL，搖勻，避光顯色15 min（溫度37 ℃），最后添加種植液，調零，測量光密度值。

1.7.2? Western blot檢測軟骨組織中noggin的蛋白表達水平? 對各組樣本進行培養(yǎng)收集，收取蛋白。用PBS緩沖液沖洗組織，加入300 μL RIPA裂解液10 min，4 ℃環(huán)境下，離心半徑為10 cm，12 000 r/min條件下離心15 min。按BCA蛋白定量試劑盒進行操作，測量濃度，再按Western blot法制膠、電泳、轉膜，放入PBST中清洗1次過夜，次日室溫放置30 min。一抗（1∶500）、二抗（1∶5000）孵育、PBST清洗3次，每次10 min。顯色、曝光：用ECL化學發(fā)光液與膜孵育1 min，濾紙吸出液體后，在成像系統(tǒng)中拍照，檢測信號轉導蛋白表達水平。

1.7.3? 關節(jié)軟骨組織病理觀察? 關節(jié)軟骨標本脫鈣后，將切片放置于恒溫箱（60 ℃）烤片1～2 h，之后二甲苯浸泡，再經(jīng)過順濃度的乙醇浸泡，蒸餾水沖洗，然后采用蘇木精染色，漂洗后，再利用伊紅染色。最后經(jīng)過順濃度梯度乙醇脫水、二甲苯浸泡、樹膠封片，顯微鏡觀察、拍照留樣。

1.8? 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。運用Shapiro-wilk法對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢測，運用Levene法進行方差檢測。計量資料以“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 大體觀察

干預6周后，取材，對各組股骨下端的關節(jié)面進行大體觀察。假手術組股骨下端關節(jié)面軟骨光滑平整，全層形態(tài)緊密，結構正常。其余3組關節(jié)面均不平整，其中桃紅四物湯組與氨基葡萄糖組軟骨總體修復情況均明顯優(yōu)于模型組。

2.2? 各組兔軟骨損傷模型關節(jié)軟骨noggin蛋白ELISA檢測結果

干預4周、6周后，與假手術組比較，模型組noggin蛋白表達升高（P<0.05）;與模型組比較，桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組noggin蛋白表達均降低（P<0.05）;與氨基葡萄糖組比較，桃紅四物湯組noggin蛋白表達低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。第4周與第6周同組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表1。

2.3? 各組兔軟骨損傷模型關節(jié)軟骨noggin蛋白Western blot檢測結果比較

干預4周、6周后，與假手術組比較，模型組noggin蛋白表達升高（P<0.05）;與模型組比較，桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組noggin蛋白表達均降低（P<0.05）;與氨基葡萄糖組比較，桃紅四物湯組noggin蛋白表達低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。第4周與第6周同組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表2、圖1。

2.4? 關節(jié)軟骨組織HE染色病理觀察

模型組移行區(qū)軟骨細胞數(shù)量大量減少，雙重潮線;桃紅四物湯組關節(jié)軟骨表面區(qū)不平整，高低不平，軟骨基質增生，膠原纖維增生，新生血管侵犯潮線;氨基葡萄糖組關節(jié)軟骨表面區(qū)不平整，高低不平，膠原纖維增生，輻射層軟骨細胞減少;假手術組表面區(qū)較平滑，全層組織正常，潮線明顯。詳見圖2。

3 討論

膝關節(jié)軟骨損傷是臨床上常見的疾病，常常由于外傷、遺傳、疾病等多種因素造成。疾病發(fā)展后期常常出現(xiàn)膝關節(jié)骨性關節(jié)炎，臨床上患者常有膝關節(jié)畸形、腫脹、行走障礙，甚至出現(xiàn)夜間的靜息疼痛等癥狀，嚴重影響患者生活質量[13]。據(jù)流行病學統(tǒng)計，全球大約有3億人患有膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis， KOA），女性發(fā)病率常常高于男性[14]。而我國55歲以上人群中，約60%的人具有KOA的影像學表現(xiàn)，65歲以上的人群中KOA的發(fā)病率達85%[15]。目前，治療膝關節(jié)軟骨損傷的方法有多種，包括手術治療、藥物治療、物理治療、肌內效貼等，但是難以改變軟骨損傷后關節(jié)退變的發(fā)展進程。而中醫(yī)學在相關領域具有獨特的優(yōu)勢[16-17]，具有無創(chuàng)、不良反應少、多靶點綜合治療的特點。

膝關節(jié)軟骨損傷歸屬于中醫(yī)學“骨痹”的范疇。王清任有關于“痹有瘀血”的論點，他主張運用活血化瘀法隨證治之。《醫(yī)林改錯·卷下》云：“總滋陰外受之邪歸于何處？總逐風寒去濕熱，已凝之血，更不能活。如水遇風寒，凝結成冰，冰成，風寒已散，明此義，治痹證何難?！闭f明該病是由多種因素而引起的經(jīng)絡阻滯、氣血不暢、筋脈攣急，病程久則損及各個臟腑，因此，瘀血是骨痹形成的重要病機。桃紅四物湯是活血化瘀的名方，方名始于吳謙所著的《醫(yī)宗金鑒·婦科心法要訣》，常用于血虛證或血瘀證，最開始用于婦科血證，為婦科病的首選方[18-19]。孫達武教授依據(jù)“有是證用是方”的理論，臨床上靈活化裁運用桃紅四物湯，有補血養(yǎng)血、活血化瘀之效，可以有效治療膝關節(jié)軟骨損傷。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白質（bone morphogenetic protein， BMP）是非常重要的骨蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，BMP信號通路能與骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells， MSCs）結合，MSCs沒有參加分化但卻具有成骨性能，從而使得MSCs發(fā)生化生反應、趨向、聚集、分化，最終變成軟骨或骨[20]。noggin是一種分泌型同二聚體糖蛋白，已被證明通過結合BMP-2、BMP-4、BMP-7、BMP-5、BMP-6、生長和分化因子-5、生長和分化因子-6[21-22]來抑制BMP信號傳導。當體內noggin高表達時，會與BMP特異性結合，從而使BMP和受體結合受阻，降低活性，抑制成骨，noggin可以抑制成骨細胞分化及其功能[23-24]，noggin與BMP蛋白最易產(chǎn)生反應的拮抗劑，通過阻止骨BMP與受體結合，來降低骨形成率。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯能抑制BMP-2蛋白表達，減少軟骨的炎癥反應，從而加快軟骨愈合的過程[22]。

有文獻證明，氨基葡萄糖對于軟骨損傷具有一定的修復作用[25-26]，所以本課題組以氨基葡萄糖作為軟骨修復的陽性對照藥，以桃紅四物湯作為干預用藥，以兔膝關節(jié)軟骨損傷模型作為研究對象，結果表明：干預4周、6周后，與假手術組比較，模型組noggin蛋白表達升高（P<0.05）;與模型組比較，桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組noggin蛋白表達均降低（P<0.05）;與氨基葡萄糖組比較，桃紅四物湯組noggin蛋白表達低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。桃紅四物湯能抑制noggin蛋白的表達，從而有利于膝關節(jié)軟骨修復，且抑制noggin蛋白表達的效果較氨基葡萄糖更優(yōu)。該實驗是關于桃紅四物湯促進軟骨新生、防治KOA的基礎性研究，對桃紅四物湯化瘀與生新的作用以及中藥機制等方面的探討均具有重要意義，但是由于本實驗組別數(shù)量設置有限，對于桃紅四物湯促進軟骨新生的最佳實驗劑量，還需要進一步設置不同濃度的桃紅四物湯組別進行干預，有待進一步探討。

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（未完待續(xù)）

（本文編輯? 賀慧娥）