陳 毓，陳曉蘭,，楊海峰,3，羅 軍，張 婷，左海萍，鄭 義

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300；2.安徽快康生物科技有限公司，宿州 234300；3.江蘇泰州動物藥品工程技術(shù)研究中心，泰州 225300)

畜禽大腸桿菌性腹瀉是規(guī)?；图s化畜禽養(yǎng)殖條件下常見的疾病之一，具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴重影響了畜禽的出欄率和經(jīng)濟效益[1]。為此，生產(chǎn)中常使用利高霉素、桿菌肽鋅、金霉素等多種抗生素來控制疾病的發(fā)生。但是大量使用抗生素，尤其是不合理的濫用抗生素會導(dǎo)致嚴重的臨床并發(fā)癥，如抗生素耐藥性和腹瀉，不利于疾病的康復(fù)；同時，帶來環(huán)境中的藥物殘留和動物源性的食品安全等問題，給人類的健康帶來了巨大的挑戰(zhàn)[2]。因此，尋求抗畜禽大腸桿菌性腹瀉的抗生素替代品成為當前的研究熱點。

中藥以其毒副作用小、殘留低、不易產(chǎn)生耐藥性等特性，及在抗菌同時能夠激發(fā)動物有機體免疫力等優(yōu)勢[3-4]，而在動物疾病防治中得到廣泛應(yīng)用。張世昌等[5]研究發(fā)現(xiàn)，三顆針、黃芪和山楂3種中藥的粗提物按一定比例組成的復(fù)方中藥制劑飼喂斷奶仔豬，能夠提高仔豬的生長性能,降低仔豬腹瀉率,達到或超過了添加抗生素的促生長效果。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，馬芷莧具有抗菌、抗病毒、增強免疫等多種藥理作用[6]；老鸛草的有效成分具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、止瀉等功效；地榆具有抗菌、抗炎、抑制腫瘤等作用；鐵莧菜具有抗菌、抗癌、止瀉等藥理活性[7]；仙人掌具有消炎、鎮(zhèn)痛、降血糖、增強免疫等生物活性[8]。

鑒于動物養(yǎng)殖中大腸桿菌病的高發(fā)病率對動物生產(chǎn)造成嚴重的影響，抗生素的應(yīng)用易導(dǎo)致細菌耐藥性和藥物殘留，而中草藥由于多靶點相互作用，不易產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留，能充分保證動物性食品的安全。本試驗通過建立大腸桿菌感染小鼠致腹瀉模型，研究五味止痢合劑(馬齒莧、老鸛草、地榆、鐵莧菜、仙人掌等多味中藥配伍而成)提取液的抗腹瀉作用，探討五味止痢合劑抗腹瀉的作用機制，為研制高效、綠色、安全的新型抗腹瀉復(fù)方中藥添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與菌種

ICR小鼠(18～22 g)，雌雄各半，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；致病性大腸桿菌O157由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物研究室贈予。

1.2 藥物與試劑

五味止痢合劑(批號：20180204)，規(guī)格100 mL(100 mL∶10 g)，由揚中牧樂動物藥業(yè)有限公司提供；鹽酸環(huán)丙沙星原料(批號：20170629)由江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司提供；ELISA試劑盒購自青島瑞和同泰生物科技有限公司；Anti-PCNA(60097-1-Ig)和Alexa fluor 594(SA00006-3、SA00006-4)均購自安諾倫(北京)生物科技有限公司；Anti-TGF-α(Bs-0066R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAPI購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、瓊脂粉、肝素鈉、生理鹽水、無水乙醇、二甲苯、30% H2O2均購自國藥集團。

1.3 方法

1.3.1 腹瀉率和保護率測定 選取120只4周齡ICR小鼠，分為五味止痢合劑高(W-H)、中(W-M)、低 (W-L) 劑量組、鹽酸環(huán)丙沙星藥物對照組(CPFX)、模型組(MC)和空白對照組(BC)，每組20只。接種細菌前禁食12 h，BC組腹腔注射0.4 mL生理鹽水，其余各組均腹腔注射0.4 mL大腸桿菌 O157 (2.6×108CFU/mL)建立腹瀉模型。 建模5 h后，BC組和MC組小鼠灌胃生理鹽水0.4 mL；W-H、W-M、W-L組小鼠分別灌胃25、20、15 mL/kg BW五味止痢合劑(分別相當于生藥2.5、2.0、1.5 g/kg BW)；CPFX組小鼠灌胃0.1%鹽酸環(huán)丙沙星溶液20 mL/kg BW。2次/d，連續(xù)給藥5 d。試驗期間，每天觀察記錄小鼠的一般行為表現(xiàn)，記錄腹瀉和死亡情況。于停藥后第14天，計算各組腹瀉率和保護率。腹瀉率(%)=每組腹瀉動物數(shù)/每組動物總數(shù)×100%。保護率(%)=每組治愈動物數(shù)/每組動物總數(shù)×100%。

1.3.2 五味止痢合劑對大腸桿菌致小鼠腹瀉的藥理學(xué)作用

1.3.2.1 分組 100只小鼠采用與1.3.1同樣的分組、建模和給藥方法，其中，MC組20只小鼠，其余各組16只小鼠，在給藥后第2天及停藥后第1、7和14天分別采集十二指腸組織和空腸備用。

1.3.2.2 十二指腸黏膜形態(tài)觀察 停藥后第14天，取十二指腸進行固定，HE染色觀察各組十二指腸標本黏膜層形態(tài)及有無異常炎性細胞浸潤等病理變化情況。

1.3.2.3 空腸sIgA抗體含量測定 每組取3只小鼠，分別于給藥后第2天及停藥后第1、7和14天采集2 cm空腸，用含蛋白酶抑制劑的PBS灌洗液2 mL充分洗脫空腸黏膜，收集灌洗液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，上清液分裝于離心管中，-70 ℃保存，采用ELISA試劑盒測定sIgA含量。

1.3.2.4 十二指腸黏膜細胞因子含量測定 每組取3只小鼠，分別于給藥后第2天及停藥后第1、7和14天采集十二指腸，稱重后按PBS∶小腸=9∶1(V/W)的比例加入無菌PBS，用組織勻漿器將小腸破碎后倒入離心管中，4 ℃、8 000 r/min離心10 min,收集上清液并分裝于離心管中，-70 ℃保存，ELISA試劑盒測定α-干擾素(IFN-α)和白介素-4(IL-4)的含量。

1.3.3 十二指腸黏膜修復(fù)因子的表達 依據(jù)1.3.1中五味止痢合劑對腹瀉小鼠防治效果的研究結(jié)果，對W-H、CPFX、MC和BC組小鼠進行腸道黏膜修復(fù)因子表達研究。依據(jù)1.3.2的方案，每組取3只小鼠，采集小鼠十二指腸進行固定，免疫熒光法檢測十二指腸黏膜修復(fù)因子增殖細胞核抗原(PCNA)和轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)的表達情況。小鼠十二指腸組織切片于37 ℃烘烤過夜，置于二甲苯中浸泡3次，每次10 min，依次經(jīng)100%、95%、90%、80%、70%、50%乙醇浸泡各2 min，蒸餾水浸泡1 min；PBS洗3次，每次5 min；抗原修復(fù)(高火至沸，轉(zhuǎn)為低火20 min)，自然冷卻；PBS洗3次，每次5 min；切片放入3% H2O2溶液，室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；PBS洗3次，每次5 min，甩干后5% BSA封閉20 min；去除BSA液，每張切片加入50 μL稀釋的一抗(Anti-PCNA、Anti-TGF-α)覆蓋組織，4 ℃過夜；PBS洗3次，每次5 min；去除PBS液，每張切片加50～100 μL相應(yīng)種屬的熒光二抗，室溫避光孵育2 h；PBS洗3次，每次5 min；去除PBS液，每張切片加50～100 μL DAPI溶液，室溫避光孵育5 min，用PBS沖洗3遍；90%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行One-Way ANOVA分析，應(yīng)用Duncan氏法進行多重比較，結(jié)果以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。用Image J軟件對免疫組化結(jié)果進行分析，計算不同時間點各組小腸黏膜修復(fù)因子PCNA和TGF-α的表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 腹瀉指標的檢測

由表1可知，W-H和W-M組在停藥后第14天，腹瀉保護率高達95%和90%，死亡率均為0，均與CPEX組相當。

表1 五味止痢合劑對腹瀉小鼠的治療效果

2.2 病理檢查

停藥后第14天，各組小鼠小腸病理檢查情況見圖1。其中W-H組大部分小鼠腸道黏膜恢復(fù)良好，少數(shù)黏膜表面小腸絨毛形態(tài)不完整，小腸絨毛排列稍紊亂，黏膜層有部分淋巴細胞浸潤；W-M組絕大部分小鼠腸道黏膜恢復(fù)較好，部分黏膜表面小腸絨毛形態(tài)不完整，小腸絨毛排列稍紊亂，黏膜層有部分淋巴細胞浸潤；W-L組大部分小鼠腸道黏膜恢復(fù)較好，部分黏膜表面小腸絨毛形態(tài)不完整，小腸絨毛排列紊亂，黏膜層有較大部分淋巴細胞浸潤；CPFX組少數(shù)黏膜表面小腸絨毛形態(tài)不完整，小腸絨毛排列紊亂，黏膜層有部分淋巴細胞浸潤；MC組黏膜表面小腸絨毛形態(tài)不完整，發(fā)生斷裂或消失，小腸絨毛排列紊亂，黏膜層有大量淋巴細胞浸潤；BC組十二指腸無明顯質(zhì)性病變,黏膜表面小腸絨毛形態(tài)完整，排列整齊，偶見少量淋巴細胞浸潤。

2.3 空腸sIgA抗體的表達

由圖2可知，給藥后第2天，各組sIgA含量均顯著低于BC組(P<0.05)，但各給藥組sIgA含量均顯著高于MC組(P<0.05)。停藥后第1和7天，各給藥組sIgA含量均上升，其中W-H、W-M組顯著高于W-L和MC組(P<0.05)，與CPFX組之間差異不顯著(P>0.05)。停藥后第14天，所有給藥組sIgA含量均有所提高，W-H、W-M和CPFX組的sIgA含量顯著高于MC組(P<0.05)，并與BC組差異不顯著(P>0.05)。

2.4 十二指腸黏膜細胞因子的分泌

由圖3可知，在給藥后第2天，除BC組外，其他各組十二指腸黏膜分泌大量IFN-α，分泌少量IL-4，且其組間差異均不顯著(P>0.05)，但與BC組呈顯著性差異(P<0.05)。在停藥后第1天，各給藥組IFN-α表達量下降，顯著低于MC組(P<0.05)，但顯著高于BC組(P<0.05)；各給藥組IL-4表達量上升，但均顯著低于BC組(P<0.05)，顯著高于MC組(P<0.05)，W-H組顯著高于W-L組(P<0.05)。在停藥后第7天，各給藥組IFN-α含量進一步下降，均顯著低于MC組(P<0.05)，但仍顯著高于BC組(P<0.05)；各給藥組IL-4含量進一步提升，顯著高于MC組(P<0.05)，但仍顯著低于BC組(P<0.05)，其中W-H組顯著高于W-L和CPFX組(P<0.05)。在停藥后第14天，各組IFN-α含量均顯著低于MC組(P<0.05)，W-H、W-M、CPFX與BC組之間均無顯著性差異(P>0.05)；各組IL-4含量均顯著高于MC組(P<0.05)，W-H組均顯著高于W-L和CPFX組(P<0.05)，但與BC組無顯著差異(P>0.05)。

圖1 各組小鼠十二指腸HE染色(400×)Fig.1 HE staining of duodenum of mice in each group (400×)

①D1，給藥后第2天；D2～D4，停藥后第1、7和14天。②同一時間不同組間比較，肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同①D1，The second day after drug administration；D2-D4，Days 1,7 and 14 after drug withdrawal.②Comparison between different groups at the same time,values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖2 各組小鼠空腸黏膜灌洗液sIgA含量Fig.2 Contents of sIgA in jejunal mucosal lavage fluid of mice in each group

圖3 各組小鼠十二指腸IFN-α和IL-4含量Fig.3 Contents of IFN-α and IL-4 in duodenum of mice in each group

2.5 十二指腸黏膜修復(fù)因子的表達

由表2可知，在給藥后第2天，W-H、CPFX和MC組中PCNA表達量相似，均顯著高于BC組(P<0.05)。在停藥后第1天，W-H、CPFX組PCNA表達量均顯著高于MC和BC組(P<0.05)。在停藥后第7天，W-H組PCNA表達量最高，且顯著高于CPFX、MC和BC組(P<0.05)。在停藥后第14天，各組PCNA表達水平均無顯著差異(P>0.05)。

由表3可知，在給藥后第2天和停藥后第14天，各組TGF-α表達量基本相似，無顯著差異(P>0.05)。在停藥后第1天，W-H和CPFX組TGF-α表達量顯著高于MC和BC組(P<0.05)。在停藥后第7天，W-H和CPFX組TGF-α表達量顯著高于BC組(P<0.05)，與MC組之間無顯著差異(P>0.05)。

表2 各組小鼠十二指腸黏膜修復(fù)因子PCNA的表達水平(n=3)

表3 各組小鼠十二指腸黏膜修復(fù)因子TGF-α的表達水平(n=3)

3 討 論

本試驗采用由馬齒莧、老鸛草、地榆、鐵莧菜、仙人掌組成的五味止痢合劑對小鼠大腸桿菌性腹瀉進行治療，選擇未達到體成熟的4周齡小鼠作為試驗動物，其目的是使試驗動物的生長階段盡可能與五味止痢合劑的臨床應(yīng)用動物(斷奶仔豬)的生長階段相一致。治療結(jié)果顯示,藥物低、中、高劑量組對腹瀉的保護率分別為70%、90%和95%，隨著濃度的增加保護率呈上升趨勢，具有一定的劑量依賴性，其中高劑量組腹瀉保護率達95%，死亡率為0，抗腹瀉效果顯著，與鹽酸環(huán)丙沙星對照組保護效果相當。五味止痢合劑處方中以馬齒莧清熱解毒、涼血止血為君藥，老鸛草、鐵莧菜、地榆清熱利濕﹑收斂止瀉為臣藥，仙人掌行氣活血、健脾止瀉為佐藥。諸藥合用，共湊清熱解毒、化濕止痢之功效[8]。從現(xiàn)代藥理學(xué)的角度來看，馬齒莧、老鸛草、地榆均具有抗菌、抗炎作用，馬齒莧和仙人掌還具有免疫增強作用。這可能是五味止痢合劑發(fā)揮良好抗大腸桿菌作用的主要原因。張亞輝[9]研究鸛榆止瀉散對小鼠大腸桿菌性腹瀉的治療效果，發(fā)現(xiàn)鸛榆止瀉散能減輕腹瀉癥狀，降低腹瀉率，該鸛榆止瀉散中發(fā)揮主要抗菌作用的是地榆，其次是老鸛草。 以上研究表明地榆和老鸛草具有作為抗大腸桿菌中藥復(fù)方主要成分的潛能。

各種原因所致的腹瀉都會導(dǎo)致腸道黏膜上皮的損傷，受損的黏膜上皮在修復(fù)生長時，受到多種生物活性因子的調(diào)節(jié)，包括IL、IFN、腫瘤壞死因子(TNF)及生長因子等[10-11]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，五味止痢合劑能顯著抑制大腸桿菌引起的腸道IFN-α細胞因子過度分泌，顯著提高大腸桿菌致腸道IL-4細胞因子的分泌不足，且成一定的時間依賴性。說明五味止痢合劑可能通過抑制腸道黏膜IFN-α的分泌，提高IL-4的表達量，有效抑制腸道炎癥反應(yīng)，促進腸道修復(fù)。研究顯示，五味止痢合劑中，馬齒莧多糖[12]、老鸛草水煎液、地榆水提物[13]、鐵莧菜水提物[14]、仙人掌多糖[15]均可調(diào)節(jié)免疫細胞因子的釋放而增強免疫功能。其中馬齒莧水提物對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有保護作用[16]。五味止痢合劑中多組分復(fù)雜分子組合體，在調(diào)控腸道黏膜炎性因子的表達中發(fā)揮協(xié)同作用。

sIgA在腸道黏膜免疫中起重要作用，作為腸黏膜上的主要免疫球蛋白，對各種外界入侵的病原體都有抵抗作用[17]。本試驗中，停藥后第14天，所有給藥組sIgA含量顯著提高，藥物高、中劑量組和鹽酸環(huán)丙沙星對照組的sIgA含量顯著高于模型對照組，最終與空白對照組相比，差異不顯著，表明五味止痢合劑可通過促進空腸黏膜分泌sIgA抗體，提升腸道黏膜免疫防御功能，促進腸道黏膜損傷的恢復(fù)。趙春萍等[18]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可促進大腸桿菌感染豬空腸黏膜sIgA的蛋白表達，有效提高腸道黏膜免疫防御功能，與本試驗的結(jié)果相似。

PCNA作為細胞增殖標志物，在受損小腸黏膜的再生與修復(fù)中發(fā)揮重要作用，主要通過增強黏膜隱窩細胞的增殖與分化，產(chǎn)生新的細胞逐漸遷移到受損部位，對受損的上皮細胞進行補充與替換，完成小腸黏膜的修復(fù)[18]。小鼠腸黏膜上皮受損后，促進TGF-α的表達，TGF-α再作用于絨毛腺窩中下區(qū)域的細胞池，促進其分化、增殖、遷移，調(diào)節(jié)胃腸道黏膜上皮細胞的更新，促進損傷部位的修復(fù)，對維持黏膜的完整性發(fā)揮重要作用[19]。本研究結(jié)果顯示，小鼠攻毒大腸桿菌后，在給藥的第2天，攻毒組十二指腸黏膜PCNA和TGF-α表達量均呈上升趨勢，可能是宿主對細菌攻擊所作出的應(yīng)激性保護反應(yīng)。隨著給藥時間的延長，在停藥后第1天，五味止痢合劑高劑量組十二指腸PCNA和TGF-α表達量顯著高于模型對照組和空白對照組，在停藥后第7天達到最大，甚至超過鹽酸環(huán)丙沙星對照組，后逐漸恢復(fù)至正常水平。表明五味止痢合劑主要通過增加腸道修復(fù)因子PCNA和TGF-α的表達促進腸道損傷的修復(fù)，修復(fù)作用優(yōu)于鹽酸環(huán)丙沙星對照組。張?zhí)襕20]研究白頭翁湯、郁金散能使感染E.Coli(O157∶H7)小鼠的TNF-α降低到感染前范圍內(nèi)；徐倩倩等[21]發(fā)現(xiàn)，白頭翁素對輪狀病毒和大腸桿菌混合感染性腹瀉小鼠的腸黏膜具有修復(fù)功能，可能與其調(diào)節(jié)黏膜修復(fù)因子PCNA和TGF-α的表達有關(guān)，其結(jié)果與本試驗具有一定的相似性。

鑒于以上研究結(jié)果，可以推測五味止痢合劑對抗大腸桿菌性腹瀉的機制可能與顯著提升空腸灌洗液中sIgA的含量，充分激活免疫細胞、調(diào)節(jié)腸道黏膜分泌的細胞因子IFN-α和IL-4、刺激腸道黏膜修復(fù)因子PCNA和TGF-α有效表達、有效抑制腸道炎癥反應(yīng)，促進腸道損傷的修復(fù)相關(guān)。

4 結(jié) 論

通過大腸桿菌建立ICR小鼠腹瀉模型，一次量灌胃五味止痢合劑25 mL/kg BW，2次/d，連用5 d，可顯著控制大腸桿菌引起的腹瀉，保護率達95%。小鼠腸道黏膜在用藥過程中逐漸恢復(fù)，在停藥后14 d 基本恢復(fù)正常。 五味止痢合劑可顯著提升空腸灌洗液中sIgA的含量，激活免疫細胞，調(diào)節(jié)腸道黏膜分泌的細胞因子IFN-α和IL-4，抑制腸道炎癥反應(yīng)，刺激腸道黏膜修復(fù)因子PCNA和TGF-α的表達。