陳思宇，隋卓君,王占新，李 強(qiáng)，陳 藝，王 飛，陳 爽,劉心怡，嚴(yán)專強(qiáng)，何 誠

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，中巴農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與服務(wù)中心，北京100193；2.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，云浮 527499)

鸚鵡熱衣原體是一類專性寄生于真核細(xì)胞內(nèi)的革蘭氏陰性病原體，可引起多種動(dòng)物頑固性呼吸道和消化道疾病，威脅著畜牧業(yè)的健康發(fā)展[1]。鸚鵡熱衣原體病在人群中也時(shí)有暴發(fā)，尤其是密切接觸寵物鳥和家禽的人群。Hogerwerf等[2]統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，鸚鵡熱衣原體感染造成1%社區(qū)獲得性肺炎，新發(fā)和死亡病例報(bào)道不斷增加，所以鸚鵡熱衣原體的防治具有重大的公共衛(wèi)生防控意義。尋找安全有效防治衣原體疾病的手段，研發(fā)制造新型的方便且安全有效的衣原體疫苗，防治鸚鵡熱衣原體的感染成為亟需解決的問題[3-4]。

佐劑可增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體對于疫苗抗原成分的特異性免疫應(yīng)答,包括免疫刺激復(fù)合物(lipophilic immune response stimulating complex，ISCOM)、霍亂弧菌菌影(Vibriocholeraeghosts，VCG)、寡聚脫氧核苷酸(CpG)佐劑、殼聚糖凝膠(Gel)佐劑等。其中ISCOM擁有抗原呈遞和佐劑的雙重功效，刺激體內(nèi)的免疫細(xì)胞活化[5]。VCG在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與天然活菌有著高度相似性，可有效增強(qiáng)沙眼衣原體MOMP蛋白刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生高水平的體液免疫應(yīng)答和Th1型免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的活化和增強(qiáng)Toll樣受體的反應(yīng)性[6]。CpG 能模擬細(xì)菌 DNA 的免疫刺激活性，有效增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，在機(jī)體抵抗病原體入侵和抗腫瘤等方面發(fā)揮一定的作用[7]。Gel有較高的生物安全性，可包裹抗原促使其持久緩慢釋放。Dixit等[8]運(yùn)用納米材料作為MOMP肽M278的佐劑，兩者聯(lián)合制作衣原體疫苗，結(jié)果顯示可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性抗體。衣原體相關(guān)的疫苗需誘導(dǎo)高水平細(xì)胞免疫的佐劑，以實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答和消除衣原體在細(xì)胞內(nèi)的寄生。

本研究旨在探究VCG和Gel復(fù)合佐劑通過呼吸道免疫途徑增強(qiáng)鸚鵡熱衣原體滅活原體(elementary body,EB)免疫應(yīng)答特點(diǎn)，以期為鸚鵡熱衣原體防控提供新的技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 60只7日齡SPF公雞購自北京勃林格殷格翰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號為110321210100412264。所有動(dòng)物操作和管理嚴(yán)格遵循2017年修訂版《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行，試驗(yàn)方法及試驗(yàn)流程經(jīng)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和利用委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)。

1.1.2 免疫材料 鸚鵡熱衣原體6BC株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院禽衣原體實(shí)驗(yàn)室提供。VCG和Gel均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院禽衣原體實(shí)驗(yàn)室制備。衣原體滅活抗原由鸚鵡熱衣原體6BC株通過紫外線滅活30 min后備用；VCG通過抗生素處理進(jìn)行殺滅。采用膜過濾法對其進(jìn)行抽提和過濾，去除內(nèi)毒素，保留其蛋白外殼。

1.1.3 試劑盒 雞鸚鵡熱衣原體ELISA抗體檢測試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院研制，包被物為MOMP抗原；雞細(xì)胞因子(白介素-4(IL-4)、IL-10、IL-12和干擾素-γ(IFN-γ))檢測試劑盒均購自 Kingfisher Biotech 公司；衣原體LPS熒光染色試劑盒購自Thermo fisher公司；BrdU 細(xì)胞增殖 ELISA 檢測試劑盒購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及免疫 60只7日齡SPF公雞隨機(jī)分成4組，分別為：殼聚糖凝膠對照組(Gel組)、鸚鵡熱衣原體滅活EB對照組(EB組)、EB+VCG和EB+VCG+Gel組，每組15羽。 7 日齡時(shí)，4組雞經(jīng)滴鼻途徑免疫含有不同佐劑的疫苗，200 μL/羽，免疫程序?yàn)槊庖?次，中間間隔14 d。試驗(yàn)動(dòng)物分組及免疫程序見表1。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及免疫程序

1.2.2 免疫后檢測指標(biāo) 首免后第7、14、21和28天采集翅靜脈血液樣本，分離血清，以鸚鵡熱衣原體ELISA檢測試劑盒檢測其血清中的特異性IgG抗體水平。

脾臟淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和細(xì)胞因子測定：首免后28 d無菌采集10只SPF雞脾臟，通過70 nm尼龍膜網(wǎng)篩制備單淋巴細(xì)胞懸液，進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞量為1×106/mL。利用BrdU特異性染料進(jìn)行標(biāo)記，以滅活的鸚鵡熱衣原體純化EB為刺激物，感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為1時(shí)測定淋巴細(xì)胞增殖能力。利用酶標(biāo)儀在450 nm波長下進(jìn)行測定，淋巴刺激指數(shù)(%)=D450 nm值刺激組/D450 nm值對照組×100%。以特異性細(xì)胞因子試劑盒檢測上述淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ含量。

CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞比例：調(diào)整上述單淋巴細(xì)胞懸液細(xì)胞量為1×105/mL。利用特異性抗雞的熒光標(biāo)簽與淋巴細(xì)胞避光共孵育30 min， 通過流式細(xì)胞儀測定其比例，評價(jià)免疫后雞的免疫應(yīng)答狀態(tài)。

1.2.3 攻毒后檢測指標(biāo) 首免后28 d對各組剩余的5只SPF雞進(jìn)行喉頭攻毒，每只雞100 μL (108IFU/mL)鸚鵡熱衣原體EB。攻毒后檢測雞喉頭排菌量，剖檢后評價(jià)肺臟病變情況。

排菌量檢測：攻毒后每隔3 d，用無菌醫(yī)用棉簽采集雞喉頭拭子，通過免疫熒光抗體試劑盒進(jìn)行計(jì)數(shù)，評價(jià)各組對衣原體的清除效果。

肺臟剖檢積分：攻毒后7 d，將每組5只雞麻醉后頸動(dòng)脈放血處死并進(jìn)行剖檢，觀察各臟器的病理變化，針對肺臟損傷進(jìn)行評分，得分為雙側(cè)統(tǒng)計(jì)總和。評分標(biāo)準(zhǔn)：單側(cè)肺臟，單側(cè)評分后需兩側(cè)相加：0分，肺臟正常，無明顯病理變化；1分，肺臟30%左右面積出血性壞死變化；2分，肺臟60%左右面積出血性或壞死性變化；3分，肺臟80%左右面積出血性或壞死性變化；4分，肺臟全部面積出血性或壞死性病理變化[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)包括淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子濃度采用單因素方差分析進(jìn)行比較，利用最小顯著差異法(least significant difference，LSD)進(jìn)行多重比較。抗體滴度和肺臟衣原體 DNA載量的數(shù)據(jù)，取對數(shù)轉(zhuǎn)化為線性數(shù)據(jù)后，采用與上述同樣的方法進(jìn)行分析,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。病變評分使用Wilcoxon and Mann-Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行分析。圖像均由GraphPad Prism 7.0軟件生成。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 免疫后IgG特異性抗體水平

首免后第7、14、21和28天采集各組SPF雞翅靜脈血液，分離收集血清，檢測鸚鵡熱衣原體特異性抗體水平。由圖1可知，IgG抗體水平呈持續(xù)上升趨勢，Gel組呈現(xiàn)較低的IgG抗體水平;EB+VCG組誘導(dǎo)中等抗體水平;EB+VCG+Gel組誘導(dǎo)的抗體水平分別顯著和極顯著高于EB+VCG和EB組(P<0.05;P<0.01)。

2.2 免疫后脾臟淋巴細(xì)胞增殖特點(diǎn)

由圖2可知，Gel組呈現(xiàn)最低的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)，EB組誘導(dǎo)較低的淋巴刺激指數(shù)，高于Gel組;EB+VCG和EB+VCG+Gel組誘導(dǎo)較高的脾臟淋巴刺激指數(shù)，且顯著性高于EB組(P<0.05)，極其顯著性高于Gel組(P<0.01);EB+VCG和EB+VCG+Gel組之間無顯著性差異(P>0.05)。

2.3 免疫后脾臟細(xì)胞因子表達(dá)水平

IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ含量檢測結(jié)果見圖3。由圖3可知，Gel和EB組細(xì)胞因子水平較低;EB+VCG和EB+VCG+Gel組誘導(dǎo)IL-12和IFN-γ含量，其中EB+VCG+Gel組誘導(dǎo)的IFN-γ含量極顯著高于EB組(P<0.01)，顯著高于EB+VCG組(P<0.05)；各組間IL-4和IL-10含量均無顯著差異(P>0.05)。

*,差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。ns,差異不顯著(P>0.05)。下同*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01).ns,Difference was not significant (P>0.05).The same as below圖1 免疫后IgG特異性抗體水平Fig.1 Specific IgG responses against Chlamydia psittaci post immunization

圖2 免疫后脾臟淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)Fig.2 Proliferation index of lymphocyte in different groups after immunization

圖3 免疫后脾臟上清液細(xì)胞因子含量Fig.3 Cytokine contents of spleen supernatants post immunization

2.4 免疫后脾臟淋巴細(xì)胞分化情況

免疫后采集雞脾臟，制作單細(xì)胞淋巴懸液，通過流式細(xì)胞儀檢測免疫后機(jī)體內(nèi)CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞比例。 由圖4、5可知，Gel和EB組中CD4+/CD8+T細(xì)胞比值較低；EB+VCG組和EB+VCG+Gel組CD4+/CD8+T細(xì)胞比值顯著或極顯著高于EB和Gel組(P<0.05；P<0.01)；EB+VCG和EB+VCG+Gel組之間無顯著差異(P>0.05)。

2.5 攻毒后鸚鵡熱衣原體的外排情況

采集喉頭拭子，通過直接免疫熒光檢測雞的排菌量，結(jié)果見圖6。由圖6可知，Gel和EB組攻毒12 d后仍保持較高的排菌量，與這2組相比，EB+VCG和EB+VCG+Gel組排毒量均極顯著降低(P<0.01)；EB+VCG+Gel組攻毒后第9天喉頭外排衣原體水平明顯降低，提示EB+VCG+Gel組誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可更快地清除體內(nèi)的衣原體。

2.6 攻毒后雞肺臟病理損傷

攻毒后第7天，剖檢觀察各組雞臟器的病理學(xué)變化，針對肺臟進(jìn)行損傷評分。由圖7、8可知，Gel和EB組表現(xiàn)出嚴(yán)重的肺部出血、纖維素樣滲出，部分雞肺臟出現(xiàn)實(shí)變，肺臟損傷評分較高；EB+VCG組大體病變呈現(xiàn)無可見的滲出性炎癥，肺臟損傷評分顯著低于Gel和EB組(P<0.05)，VCG+Gel+EB組肺臟損傷評分極顯著低于Gel和EB組(P<0.01)，同時(shí)低于EB+VCG組，但差異不顯著(P>0.05)，說明VCG可起到較好的免疫保護(hù)效力，且三者聯(lián)用效果最佳。

①A，Gel組；B,EB組；C，EB+VCG組；D，EB+VCG+Gel組。圖7同。②Q1,CD4+CD8-;Q2,CD4+CD8+;Q3,CD4-CD8+;Q4,CD4-CD8-①A，Gel group；B，EB group；C，EB+VCG group；D，EB+VCG+Gel group.The same as fig.7.②Q1,CD4+CD8-;Q2,CD4+CD8+;Q3,CD4-CD8+;Q4,CD4-CD8-圖4 免疫后CD4+ T細(xì)胞與CD8+ T細(xì)胞流式細(xì)胞圖Fig.4 CD4+ T cells and CD8+ T cells flow cytometry post immunization

圖5 免疫后CD4+/CD8+ T細(xì)胞比值Fig.5 Ratio of CD4+/CD8+ T cells post immunization

圖6 鸚鵡熱衣原體攻毒后喉頭排菌量測定Fig.6 Determination of throat excretion of Chlamydia psittaci after challenge

圖7 鸚鵡熱衣原體攻毒后肺臟病變情況Fig.7 Pathological changes of lung after Chlamydia psittaci challenge

圖8 鸚鵡熱衣原體攻毒后肺臟損傷評分Fig.8 Assessment of lung lesions post challenge

3 討 論

本試驗(yàn)用的新型鸚鵡熱衣原體疫苗由VCG、殼聚糖凝膠作為佐劑，其中殼聚糖凝膠與滅活的EB以靜電吸附方式結(jié)合，衣原體抗原附著在殼聚糖凝膠上，保證了衣原體抗原在呼吸道黏膜上緩慢釋放，實(shí)現(xiàn)了持續(xù)刺激呼吸道黏膜免疫。殼聚糖是一種天然陽離子多糖，其具有良好生物相容性、生物可降解性和黏膜黏附性[10]。為彌補(bǔ)殼聚糖不溶于水的缺點(diǎn)，Pawar等[11]評估了乙二醇?xì)ぞ厶?glycol chitosan，GC)納米粒子，以獲得經(jīng)鼻腔施用乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的全身和黏膜免疫應(yīng)答，認(rèn)為GC是一種與親水性乙二醇分支結(jié)合的水溶性兩性離子殼聚糖衍生物。殼聚糖可延長并維持抗原在不同黏膜系統(tǒng)中的停留時(shí)間[12]。此外，殼聚糖還具有高表面積與體積比及在一系列離子條件下的穩(wěn)定性，這使其適用范圍更加廣泛[13]。殼聚糖納米粒子包埋的抗原可增強(qiáng)呼吸道的黏膜IgA反應(yīng)并在感染動(dòng)物中提供有效保護(hù)[14]。由于殼聚糖所具備的各項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)了該聚合物可用于傷口敷料和組織工程中[15]。Li等[16]采用殼聚糖納米顆粒作為佐劑的疫苗同時(shí)對小鼠進(jìn)行肌肉和鼻內(nèi)免疫，誘導(dǎo)了針對鸚鵡熱衣原體的強(qiáng)烈體液、黏膜免疫和細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，從而通過降低小鼠的鸚鵡熱衣原體載量并清除鸚鵡熱衣原體以達(dá)到預(yù)防呼吸道衣原體感染的目的。Fairley等[17]利用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)包裹MOMP制作疫苗，免疫小鼠后可促使其機(jī)體細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答顯著增強(qiáng)。本試驗(yàn)采用的殼聚糖凝膠具有較強(qiáng)的黏膜吸附作用，可于免疫部位吸附抗原從而使其持久緩慢釋放，以達(dá)到長期有效的刺激效果，獲得持續(xù)穩(wěn)定的特異性抗體水平。

VCG佐劑具有成本低廉、易于大量制備、安全性好、長時(shí)間穩(wěn)定存在等優(yōu)點(diǎn)。Eko等[18]利用VCG作為遞呈系統(tǒng)，遞呈沙眼衣原體的MOMP蛋白，發(fā)現(xiàn)rVCG載體本身具有佐劑的性質(zhì)，刺激宿主產(chǎn)生強(qiáng)力的Th1型免疫應(yīng)答，同時(shí)產(chǎn)生很好的體液免疫。進(jìn)一步利用rVCG平臺(tái)同時(shí)表達(dá)Omp1和Omp2 2個(gè)抗原蛋白，證明二價(jià)苗的免疫效果明顯優(yōu)于單獨(dú)任何一個(gè)抗原。此外發(fā)現(xiàn)二價(jià)苗rVCG-PmpD/PorB不僅能有效刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答、抵抗衣原體的感染，同時(shí)能產(chǎn)生免疫記憶抵抗衣原體的再次感染。潘青[19]發(fā)現(xiàn)，rVCG-Pmp18D能促進(jìn)DC成熟，上調(diào)表達(dá)CD40、CD80、CD86、MHCⅡ分子，同時(shí)高表達(dá)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-12 p70和MCP-1，增強(qiáng)DC的抗原遞呈功能，促進(jìn)T細(xì)胞向Th1型免疫應(yīng)答分化。本試驗(yàn)也驗(yàn)證了VCG+EB組無論在誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞增殖、CD4+/CD8+T細(xì)胞比例、IFN-γ和IL-2等細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，還是在特異性抗體水平上都顯示了良好的增強(qiáng)作用。

目前，鸚鵡熱衣原體在不同家禽群體飼養(yǎng)中呈現(xiàn)較高的感染率，其中肉鴿、鴨是主要的感染宿主。隨著全基因測序的推廣和應(yīng)用，鸚鵡熱衣原體致死人的報(bào)道不斷增加。家禽衣原體疫苗以注射免疫為主，如雞衣原體基因工程疫苗。對于大規(guī)模、集約化飼養(yǎng)及體型較大的種禽(種鴨、種鵝)，注射免疫存在種禽應(yīng)激較大、人員勞動(dòng)強(qiáng)度過大、動(dòng)物福利差等不利因素。本試驗(yàn)結(jié)果表明，VCG+Gel+EB疫苗可通過滴鼻免疫方式誘導(dǎo)雞群獲得高水平的免疫保護(hù)，提示新型疫苗可采用氣霧免疫的方式實(shí)現(xiàn)大規(guī)模免疫，增強(qiáng)呼吸道黏膜免疫保護(hù)，阻斷鸚鵡熱衣原體通過呼吸道入侵，可實(shí)現(xiàn)理想的免疫保護(hù)，從而阻斷鸚鵡熱衣原體從動(dòng)物群體向人群傳播。

殼聚糖凝膠可增強(qiáng)抗原黏附呼吸道黏膜的時(shí)間，持續(xù)刺激機(jī)體IgA反應(yīng)，促使其在感染動(dòng)物中提供有效保護(hù)。VCG可起到良好的遞呈抗原作用[20]。本研究通過滴鼻免疫后測定IgG抗體水平、脾臟淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的應(yīng)答特點(diǎn)，攻毒后喉頭排出衣原體含量、肺臟損傷評分結(jié)果顯示VCG+Gel+EB疫苗優(yōu)于VCG+EB疫苗、滅活的EB疫苗，尤其可縮短排毒時(shí)間，這提示VCG與殼聚糖凝膠佐劑可增強(qiáng)鸚鵡熱衣原體滅活EB抗原的免疫保護(hù)效果，VCG+Gel+EB疫苗是一種新型黏膜免疫疫苗，有望開發(fā)成為防治鸚鵡熱衣原體的新型疫苗，豐富衣原體防治的技術(shù)措施。

綜上，本研究研制的VCG+Gel+EB滴鼻疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，獲得較高的免疫攻毒保護(hù)效果，用于防治鸚鵡熱衣原體。這種滴鼻免疫的接種方式也可進(jìn)一步升級為氣霧免疫方式，更加快速便捷，用于集約化養(yǎng)殖企業(yè)體重較大的種禽時(shí)可減少免疫應(yīng)激，降低人員勞動(dòng)強(qiáng)度和提高動(dòng)物福利。

4 結(jié) 論

由滅活鸚鵡熱衣原體EB、VCG、殼聚糖凝膠制備的新型鸚鵡熱衣原體黏膜疫苗經(jīng)鼻腔免疫后可提供較強(qiáng)的免疫保護(hù)力，阻斷鸚鵡熱衣原體從動(dòng)物群向人群的傳播。