邱潤輝，關飛虎，王梓行，郭 嘉，朱德馨，張 偉，魏春燕，霍明凱，孫志華，2，3，張 輝，2，3

(1.石河子大學動物科技學院，石河子 832000；2.新疆生產(chǎn)建設兵團動物疾病防控重點實驗室，石河子 832000；3.動物健康養(yǎng)殖國家國際聯(lián)合研究中心，石河子 832000)

細菌分泌系統(tǒng)是一類將細菌合成的蛋白質(zhì)轉運到細胞外環(huán)境或宿主體內(nèi)的系統(tǒng)，其本質(zhì)是存在于細菌細胞膜上的蛋白質(zhì)復合體。根據(jù)分泌系統(tǒng)特定的結構、組成和活性可將其分為9種不同的類型[1]。測序分析表明，布魯氏菌沒有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型分泌系統(tǒng)，具有sec依賴和sec非依賴的蛋白和鞭毛特異性的Ⅲ型分泌系統(tǒng)，以及Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型分泌系統(tǒng)[2]。布魯氏菌的分泌系統(tǒng)是布魯氏菌重要的毒力因子，在固有免疫應答反應中，布魯氏菌可以通過分泌蛋白干擾宿主細胞免疫信號通路、降低宿主細胞的免疫反應、抵御宿主細胞的殺菌功能、促進布魯氏菌的胞內(nèi)寄生[3-4]。

多銅氧化酶(MCO)又稱為藍色氧化酶，是一種含銅的糖蛋白，不易鈍化，主要由酚類化合物和銅離子構成[5]。多銅氧化酶家族包括漆酶、亞鐵氧化蛋白、亞銅氧化酶、金屬氧化酶以及銅藍蛋白等，兼具氧化性和還原性，參與生命活動過程中的多種代謝途徑[6]。多銅氧化酶對于許多致病菌具有重要的免疫學意義，當結核分枝桿菌感染人單核細胞THP-1后,黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)被激活，生成大量活性氧(ROS)，發(fā)生活性氧應激，對結核分枝桿菌進行殺傷。然而結核分枝桿菌可以通過分泌多銅氧化酶(MCO)清除細胞內(nèi)的超氧陰離子，降低被感染細胞內(nèi)活性氧含量，提高結核桿菌的胞內(nèi)生存能力[7-8]。

布魯氏菌的多銅氧化酶(BMCO)是最近通過亞細胞定位分析和β內(nèi)酰胺酶易位效應分子報告系統(tǒng)(TEM-1)新發(fā)現(xiàn)的一種新的布魯氏菌分泌蛋白，但是關于BMCO生物學功能的研究還鮮有報道[9]。本研究擬通過構建牛種布魯氏菌S2308的BMCO基因缺失株，對BMCO蛋白進行初步生物信息學分析，并研究缺失株的生長特點和胞內(nèi)生存能力，以期為后續(xù)探究布魯氏菌分泌蛋白BMCO的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

牛種布魯氏菌S2308、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、PUC19K載體、pBBR1MCS-4-BMCO重組質(zhì)粒均由新疆生產(chǎn)建設兵團動物疾病防控重點實驗室實驗室保存；pMD19-T載體、T4 DNA連接酶、DNA Maker、2×PCR Mix均購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清均購自Gibco公司；布魯氏菌液體培養(yǎng)基和布魯氏菌固體培養(yǎng)基均購自BD公司；氨芐青霉素和卡那霉素均購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 于GenBank中搜索卡那霉素抗性基因(登錄號：M77789.2)和牛種布魯氏菌S2308的BMCO基因(登錄號：CP046721.1)的上、下游同源臂基因，通過Primer Premier 6.0設計BMCO基因的上、下游同源臂和Kan基因引物，引物序列見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.2BMCO基因上、下游同源臂的擴增 以牛種布魯氏菌S2308 85 ℃滅活60 min的菌液作為模板，分別以BMCO-N和BMCO-C引物擴增BMCO基因的上、下游同源臂。PCR擴增體系25 μL：模板2 μL，上、下游引物各0.4 μL，Mix 12.5 μL，ddH2O 9.7 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收。

1.2.3Kan基因的擴增 以PUC19K質(zhì)粒作為模板，Kan-F、Kan-R為引物擴增Kan抗性基因。PCR反應體系同1.2.2，PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收。

1.2.4BMCO基因上、下游同源臂和Kan抗性基因的融合 采用巢式PCR法，第一輪PCR將BMCO-N基因、Kan抗性基因、BMCO-C基因按照比1∶1∶1混合后進行融合，PCR反應體系25 μL:DNA模板5 μL，Mix 12.5 μL，ddH2O 7.5μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，63.8 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，10個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。第二輪PCR以第一輪PCR擴增產(chǎn)物作為模板，以BMCO-N-F/BMCO-C-R為引物。 PCR反應體系同1.2.2。 PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火90 s，72 ℃延伸80 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定正確的PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收。

1.2.5 重組質(zhì)粒的構建及鑒定 將獲得的融合片段與pMD19-T載體質(zhì)粒相連接，構建pMD19-T-BMCO-Kan的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞后，涂布于氨芐、卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，篩選陽性菌落，以BMCO-N-F和BMCO-C-R為引物進行菌液PCR檢測，陽性菌液交由生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因測序鑒定。

1.2.6 布魯氏菌BMCO基因缺失株和回補株的構建及篩選 培養(yǎng)測序結果完全正確的菌液,提取質(zhì)粒后電轉至牛種布魯氏菌S2308感受態(tài)細胞中，涂布于含有卡那霉素的布魯氏菌固體培養(yǎng)基上。37 ℃、190 r/min培養(yǎng)48 h后，挑取陽性菌落進行連續(xù)10代的培養(yǎng)，對第10代菌落以BMCO-F、BMCO-R、BMCO-N-F、BMCO-C-R、Kan-N、Kan-R為引物進行PCR鑒定，鑒定正確的即為BMCO基因缺失株(S2308ΔBMCO)。 將pBBR1MCS-4-BMCO質(zhì)粒電轉至鑒定結果正確的BMCO基因缺失的菌株中，涂布于含有氨芐霉素的布魯氏菌固體培養(yǎng)基上。挑取陽性菌落，經(jīng)培養(yǎng)篩選后以BMCO-F、BMCO-C為引物進行PCR鑒定，鑒定正確的即為BMCO基因回補株(ΔBMCO::BMCOS2308)。

1.2.7 S2308和S2308ΔBMCO生長曲線的測定 分別挑選S2308、S2308ΔBMCO單克隆菌落于布魯氏菌液體培養(yǎng)基中，190 r/min、37 ℃培養(yǎng)至D600 nm值為0.8，吸取培養(yǎng)液于新鮮的布魯氏菌液體培養(yǎng)基將各試驗組中菌液調(diào)至D600 nm值為0.1后繼續(xù)在搖床培養(yǎng)。之后每2 h檢測菌液D600 nm值，直至各菌株培養(yǎng)至平臺期，并根據(jù)時間和D600 nm值繪制牛種布魯氏菌S2308和S2308ΔBMCO的生長曲線圖。

1.2.8 S2308、S2308ΔBMCO和ΔBMCO::BMCOS2308的胞內(nèi)存活試驗 將培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞RAW264.7接種于6孔板中，1×106/孔，培養(yǎng)至貼壁形成單層細胞。將處于對數(shù)生長期的牛種布魯氏菌S2308、S2308ΔBMCO和ΔBMCO::BMCOS2308以100的感染復數(shù)(MOI)侵染細胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育45 min。PBS清洗3次，加入含有2.5%慶大霉素的DMEM繼續(xù)孵育45 min。 PBS清洗3次，加入含10% FBS的DMEM在0、4、12、24、48 h后棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次后用0.01% Trition X-100裂解細胞，釋放出胞內(nèi)菌，稀釋100倍后涂布于布魯氏菌固體培養(yǎng)基上，對其進行計數(shù)。

1.2.9 布魯氏菌分泌蛋白BMCO的生物信息學分析 運用ProtParam在線軟件(https:∥web.expasy.org/protparam/)對蛋白理化性質(zhì)進行分析；采用ProtScale在線軟件(https:∥web.expasy.org/protscale/)進行親/疏水性分析；采用SignalP 4.1在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1)進行信號肽分析；通過PSORTⅡ在線程序(https:∥www.genscript.com/psort.html)進行亞細胞定位預測；采用SOPMA在線軟件(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat)進行二級結構預測；采用SWISS-MODEL在線軟件(https:∥swissmodel.expasy.org)進行三級結構預測。

1.3 統(tǒng)計學分析

每個試驗均重復5次，結果用平均值±標準差表示。采用GraphPad-Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，兩組間平均值進行t檢驗。 *表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結 果

2.1 目的基因的擴增

以牛種布魯氏菌S2308和PUC19K質(zhì)粒作為模板，利用PCR反應分別對BMCO基因的上、下游同源臂和Kan基因進行特異性擴增。結果顯示，擴增產(chǎn)物分別為522、539和1 054 bp的特異性條帶(圖1)，與預期片段大小相符，表明擴增成功。

2.2 BMCO基因的上、下游同源臂、Kan抗性基因的融合

將BMCO基因的上、下游同源臂和Kan基因3個片段按照濃度1∶1∶1的比例混合進行融合PCR，結果顯示，融合后片段大小為2 115 bp(圖2)，與預期大小相符，表明擴增成功。

2.3 重組質(zhì)粒的構建和鑒定

重組質(zhì)粒pMD19-T-BMCO-Kan經(jīng)PCR檢測獲得大小為2 115 bp的特異性條帶(圖3)，回收產(chǎn)物經(jīng)測序分析和序列比對后發(fā)現(xiàn)與預期結果一致，說明pMD19-T-BMCO-Kan重組質(zhì)粒構建成功。

A，BMCO基因上游同源臂；B，BMCO基因下游同源臂；C， Kan基因A,BMCO gene upstream homologous arm；B，BMCO gene downstream homologous arm；C，Kan gene圖1 目的基因的擴增Fig.1 Amplification of target genes

M，Super DNA Marker；1，融合后的擴增產(chǎn)物；2，陰性對照M，Super DNA Marker；1，Amplification products of fusion；2,Negative control圖2 BMCO基因上、下游同源臂和Kan抗性基因的融合Fig.2 Fusion of BMCO gene upstream and downstream homologous arms and Kan resistance gene

M，Super DNA Marker；1，以BMCO-N-F和BMCO-C-R為引物的菌液PCR產(chǎn)物；2，陰性對照M，Super DNA Marker；1，PCR products of bacterial liquid with BMCO-N-F and BMCO-C-R primers;2，Negative control圖3 重組質(zhì)粒的鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid

2.4 布魯氏菌BMCO基因缺失株及回補株的構建及篩選

對第10代陽性菌落進行PCR檢測，結果表明，以BMCO為特異性引物，缺失株中不能檢測到BMCO基因的特異性條帶，BMCO-N-F、BMCO-C-R和Kan基因引物分別檢測出現(xiàn)特異性條帶大小分別為2 115和1 054 bp(圖4A)，和預期結果相符，說明成功構建可以穩(wěn)定遺傳的BMCO基因缺失株，即S2308ΔBMCO。將pBBR1MCS-4-BMCO電轉至S2308ΔBMCO缺失株，經(jīng)培養(yǎng)，使用特異性引物(BMCO)進行檢測，結果獲得特異性大小為1 605 bp的目標條帶(圖4B),和預期結果相符，表明S2308ΔBMCO的回補株構建成功，即為ΔBMCO::BMCOS2308。

2.5 S2308和S2308ΔBMCO的生長曲線

由圖5可知，缺失株S2308ΔBMCO和親本株S2308的生長趨勢相同，說明BMCO基因缺失并不能影響布魯氏菌的生長。

M，Super DNA Marker；1，以BMCO特異性引物擴增S2308ΔBMCO的PCR產(chǎn)物；2，以BMCO外部引物擴增S2308ΔBMCO的PCR產(chǎn)物；3，以Kan基因特異性引物擴增S2308ΔBMCO的PCR產(chǎn)物；4，以BMCO特異性引物擴增S2308的PCR產(chǎn)物；5，以BMCO特異性引物擴增ΔBMCO::BMCOS2308的PCR產(chǎn)物M,Super DNA Marker;1,Amplification of PCR products of S2308ΔBMCO by BMCO specific primers；2,Amplification of PCR products of S2308ΔBMCO by BMCO external primers；3,Amplification of PCR products of S2308ΔBMCO by Kan gene specific primers；4,Amplification of PCR products of S2308 by BMCO specific primers；5,Amplification of PCR products of ΔBMCO::BMCOS2308 by BMCO specific primers圖4 布魯氏菌BMCO基因缺失株(A)及回補株(B)的構建及篩選Fig.4 Construction and screening of BMCO gene deletion strain (A) and complementary strain (B) of Brucella

圖5 布魯氏菌S2308和S2308ΔBMCO株的生長曲線Fig.5 Growth curve of S2308 and S2308ΔBMCO strains of Brucella

2.6 S2308和S2308ΔBMCO的胞內(nèi)生存能力

以S2308、S2308ΔBMCO和ΔBMCO::BMCOS2308株侵染小鼠巨噬細胞RAW264.7， 統(tǒng)計布魯氏菌在胞內(nèi)的生存情況，結果顯示，隨著時間的延長，S2308、S2308ΔBMCO和ΔBMCO::BMCOS2308株在胞內(nèi)的數(shù)量總體都呈現(xiàn)上升趨勢。與S2308株相比，S2308ΔBMCO株的胞內(nèi)生存能力均極顯著降低(P<0.01)(圖6)。

2.7 布魯氏菌分泌蛋白BMCO的生物信息學分析

預測結果表明，BMCO蛋白共含有1 605個氨基酸殘基，主要由Ala(11.6%)、Gly(9.2%)和Leu(9.0%)構成(圖7)。疏水區(qū)域遠大于親水區(qū)域，屬于疏水蛋白(圖8)。C、Y、S的最大值分別為0.131、0.300、0.851，S-mean的值為0.730，D值為0.532，信號肽主要集中在前20位氨基酸之間(圖9)。亞細胞定位結果顯示，BMCO位于細胞質(zhì)的可能性最大，為33.3%(圖10)。對BMCO的二級結構預測表明，該蛋白內(nèi)含有大量無規(guī)則卷曲、延伸鏈和α-螺旋，分別占比為48.5%、26.03% 和17.04%(圖11)，三級結構預測結果(圖12)與二級結構一致，預示BMCO可能有許多功能位點。

與S2308株相比，*,差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01);ns，差異不顯著(P>0.05)Compared with S2308 strain,*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01);ns,No significant difference (P>0.05)圖6 布魯氏菌S2308、S2308ΔBMCO和ΔBMCO::BMCOS2308株的胞內(nèi)生存狀況Fig.6 Intracellular survival of S2308,S2308ΔBMCO and ΔBMCO::BMCOS2308 strains of Brucella

圖7 布魯氏菌BMCO蛋白氨基酸組成Fig.7 Amino acid composition of BMCO protein of Brucella

圖8 布魯氏菌BMCO蛋白親/疏水性分析Fig.8 Hydrophilicity and hydrophobicity of BMCO protein of Brucella

圖9 布魯氏菌BMCO信號肽分析Fig.9 Signal peptide analysis of BMCO protein of Brucella

3 討 論

當病原體進入機體后，首先發(fā)揮作用的是固有免疫系統(tǒng)。固有免疫系統(tǒng)內(nèi)的溶菌酶、甘露糖結合凝集素等非特異性效應分子會對病原體進行初步識別。之后病原相關分子模式(PAMP)經(jīng)模式識別受體(PRR)識別，激發(fā)信號級聯(lián)傳導，活化效應細胞發(fā)生炎癥反應，對病原微生物進行清除。適應性免疫應答在最后被激活，當病原體固有免疫不能有效清除病原體時，殘存的病原體會被初始T、B淋巴細胞識別，繼而大量克隆分化為效應細胞實現(xiàn)免疫應答功能[10-11]。然而，布魯氏菌在感染小鼠后，不能引起多種效應免疫細胞的積聚，Toll樣受體(TLR)的識別能力降低，補體不能大量誘導促炎性細胞產(chǎn)生，這說明布魯氏菌已經(jīng)進化出來一系列復雜的分子機制來逃逸宿主的免疫應答機制，因此闡明布魯氏菌是如何逃避免疫應答的機制就變成了國內(nèi)外學者的研究熱點[12-13]。

圖10 布魯氏菌BMCO蛋白亞細胞定位預測Fig.10 Prediction of subcellular localization of BMCO protein of Brucella

h,α-螺旋；e,延伸鏈；t,β-轉角；c,無規(guī)則卷曲h,Alpha helix;e,Extended chain;t,Beta turn;c,Random coil圖11 布魯氏菌BMCO蛋白二級結構預測Fig.11 Secondary structure prediction of BMCO protein of Brucella

圖12 布魯氏菌BMCO蛋白三級結構預測Fig.12 Tertiary structure prediction of BMCO protein of Brucella

布魯氏菌的分泌蛋白就是其免疫逃逸的重要手段之一。作為典型的胞內(nèi)寄生菌，布魯氏菌通常定居在由質(zhì)膜形成的內(nèi)噬體中，并利用特有的分泌系統(tǒng)分泌效應蛋白，效應蛋白對于調(diào)節(jié)宿主細胞的分泌過程、改變胞內(nèi)囊泡的轉運途徑、抑制宿主細胞免疫應答，幫助布魯氏菌在細胞內(nèi)的持續(xù)性感染具有重要意義[14-15]。目前有許多關于布魯氏菌分泌蛋白的報道，如VCEC可以激活未折疊蛋白反應(UPR),導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激并誘發(fā)促炎反應[16-17]；BtpA可以抑制樹突狀細胞的成熟，破壞TLR的信號傳遞，降低核因子激活的B細胞的κ-輕鏈(NF-κB)信號通路活性[18-19]；BspB和BspF分別定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和血漿膜，它們可以抑制宿主細胞蛋白分泌途徑，增強布魯氏菌的胞內(nèi)復制能力[20]；BPE123可以通過與宿主細胞中的細胞纖毛內(nèi)轉運蛋白(IFT20)相互作用調(diào)節(jié)宿主細胞自噬功能[21]。由此可見，研究布魯氏菌的分泌蛋白對于理解布魯氏菌免疫逃逸和胞內(nèi)寄生機制具有重要意義。BMCO是在布魯氏菌上新發(fā)現(xiàn)的一種分泌蛋白，目前對于該蛋白功能的報道較少[9，22]。本試驗中，通過構建布魯氏菌S2308的BMCO基因缺失株發(fā)現(xiàn),BMCO基因缺失對布魯氏菌的生長速度并無明顯的影響，但其胞內(nèi)生存能力顯著降低。為了進一步探究分泌蛋白BMCO的生物學功能，對該蛋白進行初步的生物信息學分析，表明該蛋白為疏水性蛋白，可能定位于宿主細胞的細胞質(zhì)中，內(nèi)含有大量的無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈，這預示著BMCO可能具有多個功能位點，推測BMCO可能與宿主細胞內(nèi)的某蛋白發(fā)生相互作用，繼而影響宿主細胞的免疫學功能，提高布魯氏菌的胞內(nèi)生存能力。

MCO在大腸桿菌中定位于胞質(zhì)中，主要受到銅離子濃度的調(diào)控。當細胞中銅離子濃度增加后，MCO表達發(fā)生上調(diào)，并且能將高毒性的Cu+氧化成低毒性的Cu2+，以克服宿主細胞內(nèi)過量銅離子的毒性作用，提高大腸桿菌在胞內(nèi)的生存能力[23-24]。MCO的缺失顯著降低了結核分枝桿菌的胞內(nèi)生存能力，提高了宿主細胞內(nèi)活性氧應激水平[8]。吳同壘[9]發(fā)現(xiàn),布魯氏菌分泌蛋白BMCO和大腸桿菌、結核分枝桿菌中的MCO具有一定的相似性，其C-端都具有蛋白活性的結合位點。推測布魯氏菌分泌蛋白BMCO也參與了克服宿主細胞應激內(nèi)環(huán)境的調(diào)控機制，具體機制仍有待研究。

4 結 論

布魯氏菌分泌蛋白BMCO可能具有多個功能位點，布魯氏菌BMCO基因缺失株體外培養(yǎng)條件下與親本株生長趨勢相似；但該缺失株在小鼠單核巨噬細胞RAW264.4內(nèi)的存活能力顯著降低，這為未來研究布魯氏菌分泌蛋白BMCO的生物學功能奠定了基礎。