張麗萌，劉愛菊，李閏婷，李玉華，李 林，聶曉寧，王林青，陳龍欣，

(1.鄭州師范學(xué)院，分子生物學(xué)實驗室，鄭州 450044；2.鄭州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450044；3.滄州職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)牧工程系，滄州 061001)

Luman/CREB3募集因子(LRF或CREBRF)為Luman(或CREB3)的一種細胞轉(zhuǎn)錄因子，屬于真核轉(zhuǎn)錄因子的堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)家族的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白，普遍存在于多種細胞類型中，可與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合并影響細胞生長和增殖[1-2]。CREB3家族成員調(diào)節(jié)多種基因的表達，在急性期反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、發(fā)育、存活、分化、細胞器自動調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)分泌等方面均發(fā)揮著重要作用[3-5]。據(jù)報道，CREB3與轉(zhuǎn)錄共激活因子HCF1、丙型肝炎病毒核心蛋白[6]和樹突細胞特異性跨膜蛋白相互作用，主要參與調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程。

CREB3家族成員最初是從小鼠和人中分離出來的，其中CREBRF與果蠅dCREB-A/BBF2密切相關(guān)[7]，在介導(dǎo)DNA結(jié)合和二聚化的跨膜結(jié)構(gòu)域、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔結(jié)構(gòu)域和bZIP結(jié)構(gòu)域內(nèi)具有較大的一致性[8]，而dCREB-A/BBF2是果蠅胚胎發(fā)育所必需的，表明CREB3蛋白可能在繁殖中發(fā)揮作用。Yang等[9]研究表明，CREBRF基因在懷孕小鼠發(fā)育的各階段均顯著表達，且主要定位在著床部位。Zhao等[10]研究發(fā)現(xiàn)，通過shRNA沉默小鼠GC細胞中CREBRF基因mRNA和蛋白的表達，可能控制類固醇生成基因的表達，從而影響小鼠GC細胞周期活性，促進細胞增殖，減少雌二醇和孕酮的合成，推測CREBRF可能通過與這些蛋白相互作用來抑制卵泡閉鎖。另外，敲低CREBRF基因也會對小鼠GC細胞中基因表達產(chǎn)生影響，CREBRF基因在調(diào)節(jié)卵泡發(fā)生、排卵和黃體組織形成中都發(fā)揮著重要作用。CREBRF基因作為一種在山羊妊娠早期子宮內(nèi)膜上皮細胞中自噬的潛在激活劑，干擾其表達可阻礙細胞增殖，使細胞周期阻滯在S期階段，同時還可通過CREBRF-mTOR-自噬途徑增加CREBRF基因表達，從而顯著抑制子宮內(nèi)膜功能[11]。

目前國內(nèi)外對CREBRF基因的研究主要集中在小鼠上，對于其他哺乳動物研究較少。鑒于此，本研究擬克隆綿羊CREBRF基因，對CREBRF蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能特性進行生物信息學(xué)分析，并對CREBRF基因在綿羊不同組織中的表達水平進行檢測，以期為深入探索CREBRF基因在哺乳動物中的生物學(xué)功能及綿羊繁殖調(diào)控等提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從河北省某養(yǎng)殖場選取3只健康的1歲左右的小尾寒羊，屠宰處死后立即采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)、子宮、卵巢及輸卵管組織，迅速置于液氮中，帶回實驗室后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、TransStart?FastPfuDNA Polymerase、Trans2K Plus DNA Marker、ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；SYBR Green RT-PCR熒光染料酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司；TRIzol購自Invitrogen公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI中已公布的羊CREBRF基因序列(GenBank登錄號：NC_040267.1)，利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計特異性引物及實時熒光定量PCR引物，以綿羊GAPDH基因(登錄號：NC_019460.2)作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.4 RNA提取及cDNA合成

將-80 ℃保存的綿羊各組織分別剪碎并分裝于2 mL無酶離心管中，置于預(yù)先準備的液氮中冷凍。采用常規(guī)TRIzol法分別提取綿羊各組織總RNA，利用NanoDrop 2000分光光度計測定RNA濃度及D260 nm/D280 nm值，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。以提取的總RNA為模板，按照ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄程序：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，冰上孵育2 min。cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 綿羊CREBRF基因克隆及測序

利用Pfu高保真酶以cDNA為模板PCR擴增綿羊CREBRF基因。PCR擴增體系20 μL：上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，Pfu酶1 μL，5×PfuBuffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，ddH2O 10 μL。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收，回收后的目的片段與PUC57-T載體混合后16 ℃連接3 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，冰浴30 min，42 ℃水浴熱激70 s，再冰上孵育2 min，加入提前準備好的1 mL無菌無抗性的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、260 r/min培養(yǎng)1 h，取200 μL菌液涂布于含有卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h。挑取3個單克隆菌落搖菌并利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將條帶正確的陽性克隆送測序。

1.6 生物信息學(xué)分析

在NCBI中下載山羊(登錄號：XP_017921086)、牛(登錄號：XP_015314532)、人(登錄號：NP_001161866)、小鼠(登錄號：NP_084146)、豬(登錄號：XP_020932555.1)、犬(登錄號：XP_038519270)、馬(登錄號：XP_008508125)、雞(登錄號：XP_040538972)、鴨(登錄號：XP_038042449)和斑馬魚(登錄號：XP_005170343)的CREBRF基因氨基酸序列，利用DNAStar Lasergene(MegAlign)進行多序列比對，分析綿羊與不同物種CREBRF氨基酸序列的相似性，并利用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；利用生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測CREBRF蛋白的結(jié)構(gòu)及功能(表2)。

表2 蛋白預(yù)測分析工具

1.7 CREBRF基因在綿羊不同組織中的表達水平

以綿羊GAPDH基因作為內(nèi)參，選用SYBR Green酶對CREBRF基因進行實時熒光定量PCR檢測。PCR擴增體系10 μL：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×SYBR Green Mix混合液5 μL，ddH2O 3 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，56/60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。每組選3個樣本，設(shè)置3個重復(fù)。采用相對定量2-△△Ct法計算CREBRF基因在綿羊不同組織中的表達水平。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件中獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示,P<0.05表示差異顯著;P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊CREBRF基因克隆及測序

對綿羊不同組織RNA樣品采用紫外分光光度法測定，D260 nm/D280 nm值約為1.9，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，5S、18S和28S條帶清晰，RNA質(zhì)量較好，可滿足試驗要求。以綿羊卵巢組織cDNA為模板進行PCR擴增后，產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得片段長約1 920 bp(圖1)，與預(yù)期大小相符。測序后經(jīng) MegAlign 軟件比對發(fā)現(xiàn)，與羊CREBRF基因序列(GenBank登錄號：NC_040267.1)相似性達到100%。

圖1 綿羊CREBRF基因PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplifiation product of CREBRF gene in Ovis aries

2.2 相似性比對及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

相似性比對結(jié)果顯示，綿羊CREBRF基因氨基酸序列與山羊、牛、人、小鼠、豬、犬、馬、雞、鴨和斑馬魚的相似性分別為99.8%、99.1%、95.4%、93.6%、98.3%、97.5%、98.4%、88.0%、87.5%和61.3%(圖2)，表明在不同物種間該蛋白序列具有較高的保守性。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示，綿羊與山羊、牛的親緣關(guān)系最近，與人和小鼠次之，與斑馬魚親緣關(guān)系最遠(圖3)。

圖2 綿羊與其他物種CREBRF基因氨基酸序列相似性比對Fig.2 Similarity alignment of amino acid sequences of CREBRF gene between Ovis aries and other species

圖3 CREBRF基因氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of amino acid sequences of CREBRF gene

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì)分析 利用ProtParam在線軟件預(yù)測綿羊CREBRF蛋白理化性質(zhì)，共編碼639個氨基酸，其中谷氨酸(Glu)含量最多(10.6%)，色氨酸(Trp)含量最少(0.9%)，肽鏈N-端為蛋氨酸(Met)，帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)共115個，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)共76個(表3)。CREBR蛋白分子式為C3126H4914N858O1056S21，分子質(zhì)量為72.08 ku，由9 975個原子構(gòu)成，理論等電點(pI)為4.77，半衰期為30 h，不穩(wěn)定性指數(shù)為54.83(>40)，表明該蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；親水性平均值(GRAVY)為-0.894，脂溶指數(shù)為65.74，說明綿羊CREBRF蛋白屬于親水性蛋白。

表3 綿羊CREBRF蛋白的氨基酸組成

續(xù)表

2.3.2 親/疏水性預(yù)測 使用ProtScale工具分析CREBRF蛋白的親/疏水性，結(jié)果見圖4。由圖4可知，其疏水性最強位置為566位的丙氨酸(Val)，得分為1.756；而親水性最強位置分別是359、385、386、387位的谷氨酰胺(Gln)，得分均為-3.500。另外，CREBRF蛋白親水性區(qū)域(負分值)明顯多于疏水性區(qū)域(正分值)。表明CREBRF蛋白為親水性蛋白。

2.3.3 磷酸化位點和信號肽預(yù)測 通過NetPhos 3.1 Server在線軟件分析綿羊CREBRF蛋白的磷酸化位點，結(jié)果顯示，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點分別為49、25和13個(圖5)。通過SingnalP-4.1軟件預(yù)測綿羊CREBRF蛋白信號肽，發(fā)現(xiàn)不存在信號肽(圖6)。

2.3.4 亞細胞定位和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測 采用Cell-Ploc 2.0在線軟件預(yù)測CREBRF蛋白在細胞內(nèi)的具體位置，綿羊CREBRF蛋白主要定位在細胞核中。利用TMHMM Server v.2.0在線軟件對綿羊CREBRF蛋白跨膜區(qū)進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)(圖7)。

2.3.5 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測 利用Conserved Domains軟件對CREBRF蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，結(jié)果顯示，該蛋白525-563位氨基酸處屬于堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域或bZIP超家族成員(bZIP transcription factor)，類似人CREB3調(diào)節(jié)因子，可作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)或未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的負調(diào)節(jié)因子(圖8)。

2.3.6 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用ExPASy在線軟件預(yù)測綿羊CREBRF蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲占比分別為37.09%、10.33%、5.01%和47.57%(圖9)。 利用SWISS-MODEL在線軟件建立CREBRF蛋白三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，建模的三級結(jié)構(gòu)與4kqt.1.A具有很高的相似性，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符，具有90%的可信度(圖10)。

圖6 綿羊CREBRF蛋白信號肽預(yù)測Fig.6 Signal peptide prediction of CREBRF protein in Ovis aries

圖7 綿羊CREBRF蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.7 Transmembrane domain prediction of CREBRF protein in Ovis aries

圖8 綿羊CREBRF蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.8 Conserved domain prediction of CREBRF protein in Ovis aries

線條從長到短依次代表α-螺旋(h)、延伸鏈(e)、β-轉(zhuǎn)角(t)及無規(guī)則卷曲(c)Lines from long to short represents alpha helix (h)，extended chain (e),beta turn (t) and random coil (c)圖9 綿羊CREBRF二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9 Secondary structure prediction of CREBRF protein in Ovis aries

圖10 綿羊CREBRF三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.10 Tertiary structure prediction of CREBRF protein in Ovis aries

2.3.7 CREBRF蛋白質(zhì)互作分析 運用STRING在線軟件分析綿羊CREBRF蛋白的蛋白互作，結(jié)果顯示，CREBRF與CREB3L4、ZNF395、TRIB2、KLHL24、BNIP1、LOH12CR1、CREBL2、FBXO32、HIPK3、DNAJC16、CREB3L3、CYSLTR1、ACBD5、PJA2、ADNP、CD97、FBXO11、ATP6V0E1、KAT6A和CYSLTR1蛋白彼此間均有緊密聯(lián)系，圖形越大代表蛋白與蛋白之間的互作關(guān)系越強(圖11)。

2.4 CREBRF基因在綿羊不同組織中的表達水平

采用實時熒光定量PCR方法檢測CREBRF基因在綿羊不同組織中的表達情況，結(jié)果見圖12。由圖12可知，CREBRF基因在綿羊各組織中均有廣泛表達，其中在心臟、腎臟和卵巢中表達量相對較高，顯著高于其他組織(P<0.05)，在脾臟、淋巴結(jié)、子宮和輸卵管中表達量次之，在肝臟和肺臟中表達量最低。

圖11 綿羊CREBRF蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析Fig.11 CREBRF protein network interaction in Ovis aries

肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Value with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05);While with the same superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖12 CREBRF基因在綿羊不同組織中的相對表達量Fig.12 Relative expression of CREBRF gene in different tissues of Ovis aries

3 討 論

CREBRF也稱為cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白3，是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，已被鑒定為多種核受體的新型轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子[12-13]。關(guān)于CREBRF的研究在小鼠上較多，主要是在機體代謝[14-15]、疾病治療[16-18]和動物繁殖方面發(fā)揮著重要作用，對于其他哺乳動物的繁殖調(diào)控方面涉及較少。家畜的繁殖性能很大程度上影響著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟效益，繁殖性狀作為多基因控制的數(shù)量性狀受到多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和信號通路的共同調(diào)控，而卵泡發(fā)育則是一個內(nèi)分泌調(diào)控與外部調(diào)控相結(jié)合的復(fù)雜有序過程，卵母細胞和顆粒細胞在卵泡發(fā)育的不同階段都發(fā)揮著重要的作用[19]。研究表明，在缺氧、代謝異常、營養(yǎng)不足/過剩[14]等異常情況下，CREBRF通過哺乳動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)中的負反饋調(diào)節(jié)因子途徑引起顆粒細胞凋亡，發(fā)生卵泡閉鎖，會導(dǎo)致不孕或終止妊娠[6,20]。在小鼠顆粒細胞中通過敲低CREBRF基因的表達，可促進細胞增殖，顯著降低雌二醇和孕酮激素的表達水平，導(dǎo)致CREBRF缺陷型小鼠出現(xiàn)低皮質(zhì)酮、低體重和幼崽存活率降低[21]。目前，雖已發(fā)現(xiàn)眾多與卵泡發(fā)育密切相關(guān)的分子調(diào)節(jié)劑[14]和信號通路[22]，但對其生物學(xué)功能及具體精確機制仍然未知。

本研究克隆得到綿羊CREBRF基因CDS區(qū)全長1 920 bp，編碼639個氨基酸。根據(jù)不同物種氨基酸序列相似性比對，綿羊與山羊、牛的相似性在98%以上，與斑馬魚的相似性最低，符合生物進化規(guī)律，具有廣泛的相似性且在哺乳類動物中高度保守。通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，CREBRF蛋白在不同物種的進化過程中高度保守，推測CREBRF基因可能參與眾多的生理過程。CREBRF為不穩(wěn)定的親水性蛋白，不存在跨膜信號，但具有磷酸化特性，不存在信號肽，表明不是分泌蛋白。亞細胞定位表明，CREBRF蛋白主要定位于細胞核中，在卵母細胞及不同發(fā)育時期的卵泡中都能檢測到CREBRF基因和蛋白，推測CREBRF可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑調(diào)控GC細胞增殖、分化及凋亡，從而參與卵泡發(fā)育的一系列過程。楊延周[23]研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢的各級卵泡、凋亡的顆粒細胞中CREBRF基因均有不同程度的表達，且在發(fā)情期間的小鼠子宮、輸卵管及發(fā)情后期的卵巢中表達水平較高。通過STRING數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，綿羊CREBRF蛋白與CREB3L4、KLHL24、BNIP1、ACBD5和DNAJC16等蛋白存在互作關(guān)系。BNIP1是BH3-only蛋白家族的成員，在多種生物過程中發(fā)揮著重要作用，BNIP1顯著抑制mTOR、p70S6K1和p-p70S6K1的表達，可通過mTOR信號通路抑制HeLa細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡[24]。CREB3L4(也稱為AIbZIP、Tisp40或ATCE1)主要在前列腺組織中表達，破壞CREB3L4表達可導(dǎo)致附睪精子核異常、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和半胱天冬酶激活，使減數(shù)分裂/減數(shù)分裂后生殖細胞凋亡[25]。另外，當(dāng)細胞感受某種信號時CREB3和CREB3L4蛋白可轉(zhuǎn)位進入細胞核中，可以激發(fā)下游基因的轉(zhuǎn)錄，說明該基因可通過不同信號通路發(fā)揮調(diào)控作用。ACBD5缺陷小鼠表現(xiàn)出長鏈脂肪酸水平升高和小腦病變，ACBD5還可能維持過氧化物酶體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的接觸，以促進合成代謝和分解代謝細胞脂質(zhì)途徑的調(diào)節(jié)[26]。

研究發(fā)現(xiàn)，CREBRF基因在小鼠的心臟、腎臟、肝臟、肺臟、脂肪、骨骼肌和睪丸不同組織中均有表達[20]。本研究利用實時熒光定量分析顯示，CREBRF基因在綿羊不同組織中均有不同程度的差異表達，其中在心臟、腎臟和卵巢中的表達量較高。哺乳動物卵巢上有大量處于不同發(fā)育階段的卵泡，但只有少數(shù)卵泡能夠發(fā)育成熟并排卵，卵泡發(fā)生過程是受顆粒細胞分泌的各種因子調(diào)控的復(fù)雜生物過程。研究表明，在小鼠發(fā)情周期的不同階段及卵巢顆粒細胞中CREBRF蛋白呈現(xiàn)時空特異性表達，能夠與促凋亡蛋白Caspase-12共表達導(dǎo)致顆粒細胞凋亡，CREBRF基因可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)顆粒細胞的凋亡，并在小鼠卵泡選擇中起到關(guān)鍵作用[8,23]。因此，在綿羊卵泡發(fā)育過程中CREBRF基因可能存在潛在的繁殖調(diào)控作用。本研究下一步將利用分子生物學(xué)手段進一步闡明CREBRF基因在動物繁殖過程中的具體生物學(xué)功能和調(diào)控機制，以期為提高家畜繁殖力確定新的靶標，從而提高現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟效益。

4 結(jié) 論

本試驗克隆獲得綿羊CREBRF基因，CDS區(qū)序列1 920 bp，編碼639個氨基酸，與山羊、牛的相似性高，親緣關(guān)系最近，與斑馬魚親緣關(guān)系最遠。綿羊CREBRF蛋白無信號肽，不含有跨膜區(qū)，為親水性非跨膜蛋白，可與CREBRF與CREB3L4、ZNF395、TRIB2、KLHL24、BNIP1、LOH12CR1、CREBL2、FBXO32、HIPK3、DNAJC16、CREB3L3、CYSLTR1、ACBD5、PJA2、ADNP、CD97、FBXO11、ATP6V0E1、KAT6A和CYSLTR1等蛋白發(fā)生互作；CREBRF基因在綿羊各組織中均有表達，在心臟、腎臟和卵巢中的表達量相對較高，在肝臟和肺臟中表達量相對較低。