張 莉，盧仁睿，王慧慧，李 孟，馮衛(wèi)生, 2*，鄭曉珂, 2*

地黃苷D對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

張 莉1，盧仁睿1，王慧慧1，李 孟1，馮衛(wèi)生1, 2*，鄭曉珂1, 2*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046 2. 河南省中藥開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046

研究從地黃中分離得到的地黃苷D對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC-12細(xì)胞）的保護(hù)作用及機(jī)制。以500 μmol/L皮質(zhì)酮處理PC-12細(xì)胞24 h建立損傷模型，同時(shí)給予氟西汀和地黃苷D進(jìn)行干預(yù)，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡、活性氧（reactive oxygen species，ROS）以及線(xiàn)粒體膜電位水平；采用In-Cell Western法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、剪切型Caspase-3（cleaved Caspase-3）、B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）表達(dá)；采用高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）蛋白表達(dá)。地黃苷D明顯提高皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞存活率（＜0.05、0.01）；抑制細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)ROS水平（＜0.01）；升高線(xiàn)粒體膜電位（＜0.01）；下調(diào)細(xì)胞Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)（＜0.05）；上調(diào)BDNF蛋白表達(dá)（＜0.01）。酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，Trk B）拮抗劑K252a能夠拮抗地黃苷D對(duì)PC-12細(xì)胞凋亡的抑制作用。地黃苷D可能是通過(guò)激活BDNF-Trk B通路，抑制細(xì)胞凋亡通路，從而保護(hù)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷。

地黃苷D；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-酪氨酸激酶受體B通路；線(xiàn)粒體凋亡通路；皮質(zhì)酮；抑郁癥

抑郁癥是臨床常見(jiàn)的心境障礙疾病，主要癥狀表現(xiàn)為情感低落、喪失興趣、注意力降低、思維遲緩、言語(yǔ)動(dòng)作減少[1]。抑郁癥發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，據(jù)2019年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)的最新數(shù)據(jù)顯示，全球大約有3.5億抑郁癥患者[2]。目前臨床常用的抗郁藥類(lèi)型包括單胺氧化酶抑制劑（monoamine oxidase inhibitor，MAOI）、三環(huán)類(lèi)藥物、選擇性5-羥色胺再吸收抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）等[3]。但有報(bào)道指出，抗抑郁藥一般服用1～2周后才會(huì)逐漸起效，且一些患者服藥后產(chǎn)生性功能障礙、嗜睡、體質(zhì)量增加、失眠、惡心等不良反應(yīng)[4]。因此，從中藥中尋找抗抑郁新藥很有意義。本課題組近年來(lái)致力于從中藥中篩選出具有抗抑郁活性的化學(xué)成分，發(fā)掘抗抑郁新藥前體，以期開(kāi)發(fā)出具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗抑郁新藥。

地黃是玄參科植物地黃Libosch.的塊根，列為四大懷藥之一。地黃藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，后張仲景《金匱要略·百合狐惑陰陽(yáng)毒病脈證治》中將百合地黃湯（由百合、生地黃2味藥物組成）用于治療百合?。ㄒ环N以行、臥、飲食等皆覺(jué)不適及神情恍惚為主要表現(xiàn)的神志疾?。，F(xiàn)代藥理學(xué)研究已證實(shí)百合地黃湯能改善模型小鼠的抑郁癥狀[5]，還有研究指出地黃乙醇提取物能夠改善慢性不可預(yù)見(jiàn)性輕度應(yīng)激誘發(fā)的抑郁樣行為[6]。因此，本課題組對(duì)近年來(lái)從地黃中提取、分離得到的化合物進(jìn)行了抗抑郁活性篩選，發(fā)現(xiàn)從地黃中分離得到的地黃苷D對(duì)小鼠抑郁模型的抑郁癥狀有較好的改善作用。進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前已有報(bào)道的地黃中的抗抑郁成分有梓醇[7]、毛蕊花糖苷[8]和松果菊苷[9]，關(guān)于地黃苷D抗抑郁活性的研究尚無(wú)報(bào)道。本研究采用皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC-12細(xì)胞）損傷模型，探究地黃苷D對(duì)PC-12細(xì)胞的保護(hù)作用，以及對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)和神經(jīng)凋亡通路的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

PC-12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥材

生地黃購(gòu)自河南省焦作市溫縣，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定為玄參科多年生草本植物地黃Libosch.的干燥塊根，標(biāo)本保存在河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)研究室。

1.3 藥品與試劑

DiaionHP-20、MCIGelCHP-20購(gòu)自日本三菱化學(xué)公司；ToyopearlHW-40C、ToyopearlHW-40購(gòu)自日本TOSOH公司；SephadexLH-20購(gòu)自美國(guó)Parmacia Biotech公司；160～200目柱色譜硅膠H購(gòu)自青島海洋化工廠；RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)2110284）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清（批號(hào)20010502）購(gòu)自杭州四季青生物工程研究所；皮質(zhì)酮（批號(hào)16063）購(gòu)自美國(guó)Cayman Chemical Inc；氟西?。ㄅ?hào)T0450）購(gòu)自上海百舜生物科技有限公司；DAPI（批號(hào)C1002）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙抗、二甲基亞砜、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒、線(xiàn)粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為200200912、1121E0316、20210915、20210914；PE偶聯(lián)Annexin-V凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)9074586）購(gòu)自美國(guó)BD公司；酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，Trk B）拮抗劑K252a（批號(hào)128M4104V）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胰酶（批號(hào)J190017）、MTT（批號(hào)715F055）購(gòu)自Biosharp公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號(hào)ab13847）、B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗體（批號(hào)ab59348）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號(hào)ab32503）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體（批號(hào)ab205067）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；剪切型Caspase-3（cleaved Caspase-3）抗體（批號(hào)9661S）購(gòu)自美國(guó)CST公司；羊抗兔二抗（批號(hào)C80911-11）、羊抗鼠二抗（批號(hào)C80816-10）購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司；β-actin抗體（批號(hào)AC004）購(gòu)自美國(guó)ABclonal公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 儀器

Forma 3111型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；iMark酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Arium611VF型超純水儀（德國(guó)Sartorius公司）；微量加樣器、5810型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；ECLIPSE TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；HVA-85型全自動(dòng)高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；FACS Aria III流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；Odyssey CLx雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR公司）；高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Perkin Elmer公司）；AB204-N型萬(wàn)分之一精密分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；APEX II型質(zhì)譜儀、AVANCE 500 III型核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker公司）；DFZ-3型真空干燥箱（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠）。

2 方法

2.1 地黃苷D的制備

地黃苷D為本課題組制備[10]，具體方法：稱(chēng)取20 kg生地黃，用10倍量的95%乙醇加熱回流提取2次，對(duì)提取液進(jìn)行減壓、濃縮和離心，然后過(guò)柱洗脫。將得到的甲醇部位旋干并用10%甲醇溶液溶解濾過(guò)，濾液依次用10%、30%、50%、70%和100%甲醇水溶液洗脫；將10%甲醇部位用甲醇溶解，使用硅膠柱色譜結(jié)合ToyopearlHW-40、SephadexLH-20、MCI Gel CHP-20、ODS等進(jìn)行分離純化及干燥。最后，通過(guò)光譜技術(shù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，確定得到的單體化合物SDH-1-15（36 mg）為地黃苷D，經(jīng)高效液相色譜儀面積歸化一法測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.57%。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

PC-12細(xì)胞以4×104/mL接種于96孔板中，設(shè)置對(duì)照組、模型組、氟西?。?.3 μmol/L）組和地黃苷D（5、10、20 μmol/L）組。模型組和各給藥組加入500 μmol/L皮質(zhì)酮，各給藥組再加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，處理24 h后，每孔加入20 μL MTT，4 h后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率[11]。

細(xì)胞存活率＝給藥/對(duì)照

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

PC-12細(xì)胞以8×104/mL接種于6孔板中，設(shè)置對(duì)照組、模型組、氟西?。?.3 μmol/L）組和地黃苷D（10 μmol/L）組。模型組和各給藥組加入500 μmol/L皮質(zhì)酮，各給藥組再加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，處理24 h后，收集貼壁細(xì)胞和上清中懸浮細(xì)胞，按照PE偶聯(lián)Annexin-V凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作后上機(jī)檢測(cè)，對(duì)2和42個(gè)象限的數(shù)值之和進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)為細(xì)胞凋亡率[12]。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平

細(xì)胞處理及分組同“2.3”項(xiàng)下方法，按照ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)P3的數(shù)值進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)為細(xì)胞內(nèi)ROS含量[11]。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MMP

細(xì)胞處理及分組同“2.3”項(xiàng)下方法，按照MMP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)綠色熒光的數(shù)值進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)為線(xiàn)粒體中JC-1單體比率[13]。

2.6 In-Cell Western法檢測(cè)細(xì)胞凋亡通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)

PC-12細(xì)胞以4×104/mL接種于96孔板中，分組同“2.3”項(xiàng)下方法，在給藥處理24 h后，吸取上清，依次用甲醛固定，Triton透化，牛血清白蛋白封閉2 h后，浸泡在Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2和β-actin一抗[均以1∶200溶于牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）]中過(guò)夜孵育，再以二抗（以1∶500溶于BSA）孵育1 h，然后PBST清洗4次，5 min/次；PBS清洗1次，5 min/次，采用Odyssey CLx雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描結(jié)果，對(duì)熒光數(shù)值進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)為蛋白表達(dá)量[11]。

2.7 高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測(cè)BDNF蛋白表達(dá)

PC-12細(xì)胞以4×104/mL接種于96孔板中，設(shè)置對(duì)照組、對(duì)照＋K252a（10 nmol/L）組、模型組、模型＋K252a（10 nmol/L）組、氟西?。?.3 μmol/L）組、氟西?。?.3 μmol/L）＋K252a（10 nmol/L）組、地黃苷D（10 μmol/L）組和地黃苷D（10 μmol/L）＋K252a（10 nmol/L）組。除對(duì)照組和對(duì)照＋K252a組外，其余各組加入500 μmol/L皮質(zhì)酮，各給藥組再加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，處理24 h后，吸取上清，依次用甲醛固定，Triton透化，封閉液封閉，一抗孵育（均以1∶200溶于BSA）過(guò)夜，二抗（均以1∶500溶于BSA）孵育1 h，然后加入2 μg/mL的DAPI復(fù)染5 min，然后用PBS清洗2次，5 min/次，采用Opera Phenix高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果，對(duì)熒光數(shù)值進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)為蛋白表達(dá)量[14]。

2.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)K252a處理后的細(xì)胞凋亡情況

細(xì)胞處理及分組同“2.7”項(xiàng)下方法，按照PE偶聯(lián)Annexin-V凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行處理后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)2和42個(gè)象限的數(shù)值之和進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)為細(xì)胞凋亡率[12]。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 地黃苷D對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組細(xì)胞存活率均顯著升高（＜0.05、0.01），因此后續(xù)采用10 μmol/L地黃苷D進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2 地黃苷D對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組細(xì)胞凋亡率均顯著降低（＜0.01），表明地黃苷D能夠緩解細(xì)胞損傷。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同

圖2 地黃苷D對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞凋亡的影響(, n = 3)

3.3 地黃苷D對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

如圖3所示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高（＜0.01），細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加；與模型組相比，各給藥組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低（＜0.05、0.01），細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷降低。

3.4 地黃苷D對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞MMP的影響

如圖4所示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)JC-1單體比率顯著升高（＜0.01），即MMP降低，線(xiàn)粒體功能下降；與模型組相比，各給藥組細(xì)胞內(nèi)JC-1單體比率顯著降低（＜0.01），MMP升高，細(xì)胞損傷得到改善。

3.5 地黃苷D對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)損傷的PC-12細(xì)胞凋亡蛋白的影響

如圖5所示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞cleaved Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2均顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組相比，各給藥組細(xì)胞Bax/Bcl-2均顯著降低（＜0.05），cleaved Caspase-3/ Caspase-3降低，但不具有顯著性差異，表明地黃苷D能夠抑制皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)程。

圖3 地黃苷D對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響(, n = 3)

圖4 地黃苷D對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞MMP的影響(, n = 3)

圖5 地黃苷D對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.6 地黃苷D對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞BDNF蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞BDNF蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組細(xì)胞BDNF蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01）；給予K252a后，各給藥組細(xì)胞BDNF蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05），表明K252a可拮抗地黃苷D對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

與氟西汀組比較：&P＜0.05；與地黃苷D組比較：△P＜0.05

3.7 K252a拮抗地黃苷D對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞凋亡的抑制作用

如圖7所示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組細(xì)胞凋亡率顯著降低（＜0.01）；給予K252a后，各給藥組細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.05、0.01），表明K252a拮抗了地黃苷D對(duì)PC-12細(xì)胞凋亡的抑制作用，表明地黃苷D的抗凋亡作用可能是通過(guò)BDNF-TrkB通路介導(dǎo)的。

4 討論

抑郁癥的重要表現(xiàn)包括過(guò)高的糖皮質(zhì)激素和皮質(zhì)酮水平，兩者均可誘發(fā)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的凋亡、自噬和突觸可塑性的改變等病理變化[15]。因此可采用皮質(zhì)酮刺激神經(jīng)元細(xì)胞來(lái)模擬抑郁癥的內(nèi)環(huán)境，建立抑郁癥體外細(xì)胞模型。PC-12細(xì)胞由于具有典型的神經(jīng)元和糖皮質(zhì)激素受體特征，常被應(yīng)用于研究神經(jīng)元損傷的體外模型[16]。因此，本研究采用皮質(zhì)酮誘導(dǎo)損傷PC-12細(xì)胞建立抑郁模型，探究地黃苷D是否能夠改善細(xì)胞損傷，并進(jìn)一步探究其可能的作用機(jī)制。

抑郁癥的發(fā)病與應(yīng)激密切相關(guān)，大腦的海馬結(jié)構(gòu)最易受到高活性自由基如ROS應(yīng)激反應(yīng)損害，從而導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，故抑郁癥、ROS與神經(jīng)細(xì)胞凋亡3者之間有密切聯(lián)系[17]。臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究均發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者和模型動(dòng)物均表現(xiàn)出抗氧化物質(zhì)的減少和氧化通路的激活[18]，抑郁癥常用藥物氟西汀的抗抑郁機(jī)制涉及到其抗氧化及抑制中樞氧化應(yīng)激性損傷的功能[19]。線(xiàn)粒體是提供三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的主要場(chǎng)所，線(xiàn)粒體合成的ATP為機(jī)體提供能量，因此，線(xiàn)粒體功能對(duì)于維持細(xì)胞正常功能至關(guān)重要。線(xiàn)粒體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，其內(nèi)外膜通透性的差異可以使線(xiàn)粒體內(nèi)膜兩側(cè)形成質(zhì)子梯度，維持MMP。正常的MMP是維持線(xiàn)粒體進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生ATP的先決條件，MMP的穩(wěn)定有利于維持細(xì)胞的正常生理功能[20]。線(xiàn)粒體酶呼吸鏈可產(chǎn)生ROS，一些刺激會(huì)導(dǎo)致ROS水平異常增高，從而導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜通透性改變，引起MMP的降低，誘導(dǎo)線(xiàn)粒體功能紊亂[21]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞在不同因子作用下發(fā)生凋亡時(shí)均伴有MMP的下降，且MMP在細(xì)胞凋亡早期病理變化以前就開(kāi)始下降，該過(guò)程早于DNA片段化[22]。本研究結(jié)果顯示，皮質(zhì)酮誘導(dǎo)后的細(xì)胞ROS水平上升，MMP明顯下降，凋亡水平明顯上升；地黃苷D給藥后有效抑制了ROS水平，提升了MMP水平，降低了凋亡水平。

與氟西汀組比較：&P＜0.05；與地黃苷D組比較：△△P＜0.01

細(xì)胞凋亡途徑根據(jù)啟動(dòng)過(guò)程主要包括線(xiàn)粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑3種途徑，而線(xiàn)粒體途徑在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中承擔(dān)著重要角色[23]。當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，ROS過(guò)度積累，導(dǎo)致機(jī)體抗氧化系統(tǒng)紊亂，體內(nèi)氧自由基代謝失衡誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激，損傷線(xiàn)粒體，使細(xì)胞MMP下降，進(jìn)而導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜通透性發(fā)生改變，從而促進(jìn)一系列凋亡因子（如Bcl-2家族、Caspase家族等）釋放，引起細(xì)胞凋亡[22]。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡和線(xiàn)粒體外膜完整性的調(diào)控中都有很重要的功能。Bax是最早發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族促凋亡蛋白，它在正常細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，受到凋亡刺激后發(fā)生構(gòu)象變化，轉(zhuǎn)位到線(xiàn)粒體上，直接寡聚化或與線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔道相互作用，在線(xiàn)粒體的外膜形成大的孔道，引起細(xì)胞色素C的釋放，激活下游Caspases凋亡反應(yīng)[24]。Bcl-2可以通過(guò)抑制Bax孔道的形成抑制凋亡。Caspases是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中的具有相似結(jié)構(gòu)的天冬氨酸蛋白水解酶，其級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者[25]。Bax/Bcl-2值的增加能夠誘導(dǎo)線(xiàn)粒體功能障礙，從而釋放一些凋亡相關(guān)因子，激活下游細(xì)胞凋亡過(guò)程中關(guān)鍵的執(zhí)行分子之一Caspase-3的表達(dá)，使其被切割活化為cleaved Caspase-3，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26]。抗抑郁藥物可以通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[27]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)皮質(zhì)酮刺激后，細(xì)胞內(nèi)凋亡通路關(guān)鍵蛋白cleaved Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2值均明顯上升；經(jīng)地黃苷D處理后，Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3/Caspase-3的比值均有不同程度地降低，表明地黃苷D能夠通過(guò)抑制線(xiàn)粒體凋亡途徑，保護(hù)PC-12細(xì)胞免受皮質(zhì)酮損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，BDNF是抗抑郁藥物的重要靶點(diǎn)[28]。BDNF在海馬和皮層高表達(dá)，由神經(jīng)元合成，是5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）能神經(jīng)元的生長(zhǎng)因子，可以營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)5-HT能神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)，促使神經(jīng)突觸重塑，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的合成。有研究表明，激發(fā)抑郁癥產(chǎn)生的神經(jīng)源性壓力可促使BDNF表達(dá)降低[29]。給予藥物治療后，抑郁模型大鼠腦內(nèi)BDNF含量增加[30]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，抗抑郁藥物或電休克治療后，BDNF水平升高[31]。進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，BDNF的抗抑郁作用可通過(guò)Trk B激活、-甲基--天冬氨酸受體（-methyl--aspartic acid receptor，NMDA）受體活性增強(qiáng)以及抗氧化3條途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中Trk B受體激活可以通過(guò)2個(gè)方面來(lái)實(shí)現(xiàn)，一是BDNF和Trk B結(jié)合后，使環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）磷酸化，CREB在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、抑郁、成癮、生理周期調(diào)控和長(zhǎng)期記憶的形成中發(fā)揮重要作用；二是Trk B與BDNF結(jié)合被激活后，Trk B形成同型二聚體，導(dǎo)致酪氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而激活其下游多條信號(hào)通路，包括磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）和磷脂酶C（phospho-1ipase C，PLC)這些有助于神經(jīng)元正常發(fā)育生存與分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而發(fā)揮抗抑郁作用[28]。因此，Trk B在BDNF發(fā)揮抗抑郁作用的過(guò)程中有著重要意義。K252a是Trk B拮抗劑，可以通過(guò)阻斷BDNF與其受體Trk B的結(jié)合，阻斷BDNF-Trk B通路[32]。在免疫熒光檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)酮誘導(dǎo)后PC-12細(xì)胞內(nèi)BDNF表達(dá)明顯下降，而地黃苷D能有效提高細(xì)胞內(nèi)BDNF表達(dá)，從而改善細(xì)胞損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，給予K252a后，地黃苷D對(duì)PC12細(xì)胞BDNF表達(dá)的上調(diào)作用明顯減弱，表明K252a可以拮抗地黃苷D的神經(jīng)保護(hù)作用，表明BDNF-Trk B通路是地黃苷D的神經(jīng)保護(hù)作用的相關(guān)通路，BDNF是地黃苷D發(fā)揮抗抑郁作用的靶點(diǎn)之一。本研究結(jié)果表明，地黃苷D發(fā)揮抗抑郁作用，一方面是由于抑制了高濃度皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，另一方面是由于提高BDNF表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和修復(fù)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，2種作用相互促進(jìn)，共同發(fā)揮抗抑郁作用。

有研究指出，機(jī)體內(nèi)BDNF表達(dá)的上升可以下調(diào)Bax、Caspase-3的表達(dá)，從而發(fā)揮抗凋亡作用而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[33]。還有研究者發(fā)現(xiàn)當(dāng)BDNF與Trk B結(jié)合并磷酸化酪氨酸515位點(diǎn)時(shí)，還會(huì)激活PI3K-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路，進(jìn)而抑制凋亡通路的啟動(dòng)[34]。因此本研究進(jìn)一步考察了加入TrkB拮抗劑K252a后，在阻斷BDNF-Trk B通路的情況下對(duì)凋亡水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地黃苷D對(duì)PC-12細(xì)胞凋亡的抑制作用可以被K252a拮抗，表明BDNF-Trk B通路可能處于凋亡通路的上游，地黃苷D抑制凋亡通路可能是由BDNF-TrkB通路介導(dǎo)的。

綜上所述，地黃苷D可能是地黃發(fā)揮抗抑郁作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。地黃苷D可有效緩解由高濃度皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能為提高BDNF表達(dá)，并通過(guò)BDNF-TrkB通路發(fā)揮抗凋亡作用，最終保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，從而發(fā)揮抗抑郁作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 劉宗鳳. 腦電指標(biāo)與老年抑郁癥的相關(guān)性研究 [J]. 山東醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào), 2021, 43(3): 215-217.

[2] Taciak P P, Lysenko N, Mazurek A P. Drugs which influence serotonin transporter and serotonergic receptors: Pharmacological and clinical properties in the treatment of depression [J]., 2018, 70(1): 37-46.

[3] 王建軍, 張文廣. 抑郁癥治療中藥物相互作用引起的反應(yīng) [J]. 兵團(tuán)醫(yī)學(xué), 2017, 52(2): 58-60.

[4] Braund T A, Tillman G, Palmer D M,. Antidepressant side effects and their impact on treatment outcome in people with major depressive disorder: An iSPOT-D report [J]., 2021, 11(1): 417.

[5] 趙洪慶, 唐林, 吳碧茹, 等. 百合地黃湯抑制NLRP3炎癥小體激活改善焦慮性抑郁癥模型大鼠海馬神經(jīng)元損傷 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2021, 27(20): 7-14.

[6] Wang J M, Pei L X, Zhang Y Y,. Ethanol extract ofexerts antidepressant-like effects on a rat chronic unpredictable mild stress model by involving monoamines and BDNF [J]., 2018, 33(3): 885-892.

[7] 張江南, 劉克辛. 梓醇的研究進(jìn)展 [J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2019, 42(8): 1680-1684.

[8] 王維剛, 王芃, 陽(yáng)志強(qiáng), 等. 毛蕊花糖苷藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 國(guó)際藥學(xué)研究雜志, 2020, 47(12): 1078-1087.

[9] 王慧慧, 盧仁睿, 張莉, 等. 地黃中松果菊苷對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞凋亡的抑制作用及機(jī)制研究 [J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 2021, 37(18): 2447-2450.

[10] 馮衛(wèi)生, 李孟, 鄭曉珂, 等. 生地黃化學(xué)成分研究 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2014, 49(17): 1496-1502.

[11] 張莉, 王慧慧, 徐瑞豪, 等. 皂角刺提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究 [J]. 中藥材, 2020, 43(6): 1473-1477.

[12] 馮衛(wèi)生, 楊方方, 張莉, 等. 南葶藶子水提物對(duì)多柔比星誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的抑制作用 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2018, 53(23): 1999-2007.

[13] 鄭曉珂, 楊方方, 張莉, 等. 南葶藶子抑制氧化應(yīng)激與自噬通路抗H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷作用研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(1): 157-165.

[14] 張?chǎng)? 宋俊科, 朱曉瑜, 等. 異鼠李素激活Sirt1/PGC-1α信號(hào)通路抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 54(11): 1976-1981.

[15] 趙慧亮, 高耀, 向歡, 等. 復(fù)方柴歸方對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及轉(zhuǎn)錄組學(xué)機(jī)制研究 [J]. 中藥藥理與臨床, 2021, 37(2): 126-132.

[16] Jin W Q, Xu X H, Chen X N,. Protective effect of pig brain polypeptides against corticosterone-induced oxidative stress, inflammatory response, and apoptosis in PC12 cells [J]., 2019, 115: 108890.

[17] 孫陽(yáng), 圖婭, 郭郁, 等. 針刺對(duì)慢性束縛應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬凋亡相關(guān)因子的影響 [J]. 針刺研究, 2019, 44(6): 412-418.

[18] Abuelezz S A, Hendawy N, Magdy Y. Targeting oxidative stress, cytokines and serotonin interactions via indoleamine 2,3 dioxygenase by coenzyme Q10: Role in suppressing depressive like behavior in rats [J]., 2017, 12(2): 277-291.

[19] Safhi M M, Qumayri H M, Masmali A U M,. Thymoquinone and fluoxetine alleviate depression via attenuating oxidative damage and inflammatory markers in type-2 diabetic rats [J]., 2019, 125(2): 150-155.

[20] 劉珂娣, 段佳林, 蘇晶, 等. 紫鉚花素對(duì)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及對(duì)線(xiàn)粒體功能的影響研究 [J]. 中國(guó)藥房, 2020, 31(24): 2974-2981.

[21] Anderson G, Maes M. Oxidative/nitrosative stress and immuno-inflammatory pathways in depression: Treatment implications [J]., 2014, 20(23): 3812-3847.

[22] 武冬, 符瑩瑩, 劉丹平, 等. 艾司洛爾對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位及心肌組織NF-κB表達(dá)的影響 [J]. 生物醫(yī)學(xué)工程與臨床, 2019, 23(4): 379-386.

[23] 朱玲玲, 趙捷平, 竇勤玲, 等. 線(xiàn)粒體凋亡途徑在槲皮素誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡中的作用研究 [J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2018, 34(10): 1466-1471.

[24] 馬淇, 劉壘, 陳佺. 活性氧、線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換與細(xì)胞凋亡 [J]. 生物物理學(xué)報(bào), 2012, 28(7): 523-536.

[25] 王瓏, 王實(shí)濤. 抑郁癥氧化應(yīng)激發(fā)病機(jī)制及針刺治療研究進(jìn)展 [J]. 針灸臨床雜志, 2017, 33(11): 76-80.

[26] 王春景, 盛月, 周強(qiáng), 等. 香葉木素通過(guò)線(xiàn)粒體凋亡途徑對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖及凋亡的影響 [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2020, 31(2): 149-155.

[27] 劉林, 劉檢, 劉羽, 等. 百事樂(lè)加味方對(duì)腦卒中后抑郁模型大鼠海馬-前額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡蛋白的影響 [J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志, 2019, 26(4): 61-67.

[28] 徐嘉珂, 白潔. BDNF及其受體在抗抑郁癥中的作用及其機(jī)制研究 [J]. 生命科學(xué), 2014, 26(4): 357-361.

[29] 張峻, 孟虹媛, 楊偉. 百樂(lè)眠膠囊聯(lián)合喹硫平治療輕中度抑郁癥的臨床研究 [J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2021, 36(8): 1599-1603.

[30] 鄒海艷, 楊亦龍, 屠蘅菁, 等. 解郁安神中藥對(duì)抑郁模型大鼠神經(jīng)遞質(zhì)及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響 [J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 38(9): 611-618.

[31] Zhu J X, Hu W Q, Dong S Q,. Hippocampal BDNF signaling is required for the antidepressant effects of perillaldehyde [J]., 2019, 71(3): 430-437.

[32] 張繼紅, 李?lèi)?ài)敏, 陳松, 等. 阻斷TrkB-BDNF信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響 [J]. 中國(guó)當(dāng)代兒科雜志, 2008, 10(1): 47-50.

[33] 屈紅林, 謝軍, 陳嘉勤, 等. 有氧運(yùn)動(dòng)激活BDNF/miR-195/Bcl-2信號(hào)通路抑制CUMS抑郁小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡 [J]. 天津體育學(xué)院學(xué)報(bào), 2018, 33(2): 148-155.

[34] 甘世明, 金戈. BDNF信號(hào)通路調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2019, 39(13): 3325-3330.

Protective effect and mechanism of rehmannioside D on PC-12 cells injury induced by corticosterone

ZHANG Li1, LU Ren-rui1, WANG Hui-hui1, LI Meng1, FENG Wei-sheng1, 2, ZHENG Xiao-ke1, 2

1. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Henan Engineering Technology Research Center for Chinese Medicine Development, Zhengzhou 450046, China

To study the protective effect and mechanism of rehmangoside D isolated fromon PC-12 cells induced by corticosterone.PC-12 cells were treated with 500 μmol/L corticosterone for 24 h to establish an injury model, fluoxetine and rehmangoside D were given for intervention at the same time. Cell viability was detected by MTT method; Intracellular apoptosis, reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial membrane potential levels were determined by flow cytometry; In-Cell Western method was used to detect intracellular apoptosis-related protein cysteine-aspartate protease-3 (Caspase-3), cleaved Caspase-3, B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) and Bcl-2 associated X protein (Bax) expressions; High-content cell imaging system was used to detect intracellular brain-derived neurotrophic factor (BDNF) protein expression.Rehmangoside D significantly increased the survival rate of PC-12 cells induced by corticosterone (< 0.05, 0.01), inhibited cell apoptosis and intracellular ROS level (< 0.01), increased mitochondrial membrane potential (< 0.01); Expression of Bax/Bcl-2 protein was down-regulated (< 0.05); BDNF protein expression was up-regulated (< 0.01). Tyrosine kinase receptor B (Trk B) antagonist K252a could antagonize the inhibitory effect of rehmangoside D on apoptosis of PC-12 cells.Rehmangoside D may protect PC-12 cells from corticosterone-induced injury by activating BDNF-Trk B pathway and inhibiting apoptosis pathway.

rehmannioside D; brain-derived neurotrophic factor-tyrosine kinase receptor B pathway; mitochondria dependent apoptotic pathway; corticosterone; depression

R285.5

A

0253 - 2670(2022)11 - 3385 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.014

2022-02-17

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1702800）；河南省重大科技專(zhuān)項(xiàng)（171100310500）；河南省高層次人才特殊支持“中原千人計(jì)劃”項(xiàng)目（ZYQR201810080）；河南省教育廳河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（212102311106）；河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專(zhuān)項(xiàng)課題（20-21ZY2151）；國(guó)家留學(xué)基金委訪問(wèn)學(xué)者項(xiàng)目（201908410093）；河南中醫(yī)藥大學(xué)2018年度博士科研基金資助項(xiàng)目（BSJJ2018-04）

張 莉（1986—），女，博士，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究。E-mail: sonny.fairy.love@163.com

馮衛(wèi)生，男，教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究。E-mail: fwsh@hactcm.edu.cn

鄭曉珂，女，教授，從事中藥活性及其作用機(jī)制研究。Tel: (0371)60190296 E-mail: zhengxk.2006@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]