李軍鴿，趙 瑩，王永春，孟珈同，邱智東，唐秋竹

黃連解毒湯物質(zhì)基準(zhǔn)量值傳遞分析

李軍鴿，趙 瑩，王永春，孟珈同，邱智東，唐秋竹*

長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117

闡明黃連解毒湯（Huanglian Jiedu Decoction，HJD）物質(zhì)基準(zhǔn)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，建立HJD物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜并測定其中鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃柏堿、黃芩苷、梔子苷含量及其轉(zhuǎn)移率，為后期HJD的復(fù)方制劑研究奠定基礎(chǔ)。按古代工藝制備15批物質(zhì)基準(zhǔn)，測定出膏率，建立物質(zhì)基準(zhǔn)的HPLC指紋圖譜并進(jìn)行相似度評價(jià)，確定共有峰，同法測定物質(zhì)基準(zhǔn)中8種成分的含量，進(jìn)行飲片到物質(zhì)基準(zhǔn)量值傳遞分析。15批HJD物質(zhì)基準(zhǔn)平均出膏率為16.02%，指紋圖譜共有18個(gè)共有峰，與對照指紋圖譜的相似度均大于0.9；指認(rèn)出8個(gè)色譜峰分別為鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃柏堿、黃芩苷、梔子苷。各指標(biāo)成分從飲片到物質(zhì)基準(zhǔn)的轉(zhuǎn)移率分別為鹽酸黃連堿0.61%～1.08%，表小檗堿0.14%～0.24%，鹽酸巴馬汀0.93%～1.52%，鹽酸小檗堿4.09%～6.36%，鹽酸藥根堿0.81%～1.07%，鹽酸黃柏堿0.78%～1.06%，黃芩苷7.45%～12.26%，梔子苷0.42%～2.82%。指紋圖譜結(jié)合出膏率和多指標(biāo)成分含量測定對HJD物質(zhì)基準(zhǔn)進(jìn)行量值傳遞研究，為HJD物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量控制及復(fù)方制劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

黃連解毒湯；物質(zhì)基準(zhǔn)；指紋圖譜；鹽酸黃連堿；表小檗堿；鹽酸巴馬?。畸}酸小檗堿；鹽酸藥根堿；鹽酸黃柏堿；黃芩苷；梔子苷；量值傳遞

黃連解毒湯（Huanglian Jiedu Decoction，HJD）是清熱解毒的經(jīng)典名方，主治三焦實(shí)熱火毒證[1-2]。最早記載于東晉葛洪撰寫的《肘后備急方》，后由唐代王燾在《外臺(tái)秘要》中命名為黃連解毒湯[3-4]，原文“黃連三兩，黃芩，黃柏各二兩，梔子十四枚擘，以水六升，煮取二升，分二服”。該方配伍精煉，四藥均為清熱解毒之要藥，合用后苦寒直折。黃連清瀉心火，為君藥，黃芩清肺熱，瀉上焦之火，為臣藥。黃柏瀉下焦之火，梔子清瀉三焦之火。HJD臨床療效顯著，一直受歷代醫(yī)家廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)代研究報(bào)道，HJD主要含生物堿類和黃酮類化學(xué)成分[5]，具有抗炎、抑菌、保護(hù)心血管、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等作用[6-10]。目前，關(guān)于HJD質(zhì)量控制研究和物質(zhì)基準(zhǔn)量值傳遞研究的文獻(xiàn)報(bào)道極少，本研究經(jīng)查閱文獻(xiàn)對原文信息進(jìn)行考證，通過確定遵古制備工藝的基礎(chǔ)上，通過隨機(jī)數(shù)表法組合制備15批HJD物質(zhì)基準(zhǔn)，并對其進(jìn)行指紋圖譜研究，結(jié)合表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、鹽酸巴馬汀、梔子苷、黃芩苷8種指標(biāo)成分含量轉(zhuǎn)移率范圍，出膏率范圍，進(jìn)行飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)的量值傳遞分析及整體質(zhì)量研究。為HJD質(zhì)量控制和制劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC2030型高效液相色譜儀，日本島津公司；2-4 LS-Cplus型真空冷凍干燥機(jī)，德國Epsilon公司；KQ-250B型超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；XS105DU十萬分之一電子天平、德國ME204E萬分之一電子天平，德國梅特勒-托利多公司；陶瓷煎藥壺，潮州市潮安區(qū)龍湖鎮(zhèn)神養(yǎng)電器廠。

1.2 試藥與藥材飲片

對照品鹽酸小檗堿（批號(hào)111638-201907，質(zhì)量分?jǐn)?shù)85.9%）、鹽酸黃連堿（批號(hào)112026-201802，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.0%）、鹽酸巴馬?。ㄅ?hào)110723- 201913，質(zhì)量分?jǐn)?shù)85.7%）、鹽酸藥根堿（批號(hào)110733-201609，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.5%）、鹽酸黃柏堿（批號(hào)111895-201805，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.9%）、梔子苷（批號(hào)110749-201919，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.1%）、黃芩苷（批號(hào)110715-201318，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.3%），以上對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；對照品表小檗堿，批號(hào)B20108，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，購于源葉生物技術(shù)有限公司；甲醇，美國Fisher公司，色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。15批黃連、黃芩、黃柏和梔子飲片均購于吉林省北藥藥材加工有限公司，由長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定與炮制教研室主任翁麗麗教授鑒定，黃連為毛茛科黃連屬植物黃連Franch.的干燥根莖，黃芩為唇形科黃芩屬植物黃芩Georgi的干燥根，黃柏為蕓香科黃檗屬植物黃皮樹Schneid的干燥樹皮，梔子為茜草科梔子屬植物枙子Ellis的干燥果實(shí)種子[11]。HJD中各飲片信息和物質(zhì)基準(zhǔn)（S1～S15）組合信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 HJD物質(zhì)基準(zhǔn)制備

《外臺(tái)秘要》記載“黃連三兩，黃芩，黃柏各二兩，梔子十四枚擘，以水六升，煮取二升，分二服”。唐代“一兩”折合現(xiàn)代13.8 g，唐代“一升”折合現(xiàn)代200 mL[12-14]，故折算后取黃連41.4 g，黃芩27.6 g，黃柏27.6 g，梔子15 g，加水1200 mL，武火（2200 W）加熱至沸騰，后文火（800 W）煎煮40 min，立即用2層200目紗布趁熱濾過，得藥液400 mL，冷凍干燥72 h，得HJD物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉，按表1飲片對應(yīng)制備15批HJD物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉（S1～S15）。同法制備各單味藥飲片的單煎液凍干粉及缺黃連處方、缺黃芩處方、缺黃柏處方、缺梔子處方藥材飲片的黃連陰性、黃芩陰性、黃柏陰性、梔子陰性溶液凍干粉。

2.2 HJD物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜的建立

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、鹽酸巴馬汀、梔子苷、黃芩苷對照品適量，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為1.9、9.8、11.3、11.2、15.5、14.7、19.3、19.9 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取凍干粉0.2 g，精密加甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min（250 W功率、70 Hz頻率），稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾紙濾過，取續(xù)濾液1 mL，加甲醇定容于10 mL量瓶中，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 色譜條件 色譜柱為Sepax Bio-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.05%磷酸水溶液-甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～25 min，20%～45%甲醇；25～50 min，45%～60%甲醇；50～70 min，60%～80%甲醇；70～71 min，80%～20%甲醇；71～85 min，20%甲醇；檢測波長為238 nm；柱溫為35 ℃；體積流量為0.6 mL/min；混合對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣量均為5 μL。理論塔板數(shù)（）以保留時(shí)間（R）和峰寬（）按＝16(R/)2計(jì)算，各共有峰均不低于5000。

表1 HJD中各飲片來源信息及物質(zhì)基準(zhǔn)組合

Table 1 Source information and material benchmark combination table in HJD

編號(hào)黃連黃芩黃柏梔子 批號(hào)產(chǎn)地批號(hào)產(chǎn)地批號(hào)產(chǎn)地批號(hào)產(chǎn)地 S120210724四川樂山20200715河北承德20210427四川雅安20200915四川宜賓 S220200523重慶奉節(jié)20210507河北豐寧20201023四川沐川20201107四川廣元 S320210614湖北利川20210628四川崇州20200905重慶奉節(jié)20201027河南南陽 S420210415重慶開縣20210413山東臨沂20210613湖南隆回20210423四川樂山 S520200718湖北來鳳20201003河南盧氏20210405重慶南川20200817廣西九江 S620210527陜西安康20200916陜西合陽20201103甘肅康縣20210526福建寧德 S720200513四川峨眉20200825甘肅武山20210329湖北荊州20210407江西樟樹 S820200803四川大邑20210524山西夏縣20200804四川達(dá)州20210321福建福鼎 S920210705四川崇州20200926山西運(yùn)城20210307吉林通化20200715重慶江津 S1020210511四川洪雅20201005四川樂山20200712內(nèi)蒙古赤峰20201115內(nèi)蒙古赤峰 S1120210417重慶開縣20200829四川崇州20210322吉林白山20200521內(nèi)蒙古赤峰 S1220210507四川洪雅20201005山西運(yùn)城20200806四川沐川20200724四川廣元 S1320200913四川大邑20200120甘肅武山20200506內(nèi)蒙古赤峰20201009四川樂山 S1420210512四川崇州20201111山東臨沂20201011四川達(dá)州20200921河南南陽 S1520200403重慶奉節(jié)20200725河北承德20200513四川雅安20201121四川宜賓

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取編號(hào)S1物質(zhì)基準(zhǔn)樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件連續(xù)測定6次，以鹽酸小檗堿為參照（s），計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果18個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD為0.05%～0.19%，相對峰面積的RSD為0.21%～2.07%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1物質(zhì)基準(zhǔn)樣品按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，以鹽酸小檗堿為參照（s），計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，18個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD為0.45%～0.58%，相對峰面積的RSD為1.17%～2.29%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1物質(zhì)基準(zhǔn)樣品按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，共6份，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以鹽酸小檗堿為參照（s），計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，18個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD為0.12%～1.26%，相對峰面積的RSD為0.95%～1.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 指紋圖譜的測定及飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜的量值傳遞關(guān)系研究 取15批HJD物質(zhì)基準(zhǔn)樣品（S1～S15）的供試品溶液，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件，以S1為對照，生成HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜，見圖1。相似度結(jié)果為0.976～0.999，見表2，符合指紋圖譜要求。15批HJD物質(zhì)基準(zhǔn)樣品共有18個(gè)共有峰，與單味藥飲片及其陰性比對見圖2，其中峰1（黃柏堿）為黃柏專屬峰；峰2、4（梔子苷）為梔子專屬峰；3、5、6、12（鹽酸小檗堿）為黃連和黃柏共有峰；峰7、9（表小檗堿）、10（鹽酸黃連堿）、11（鹽酸藥根堿）、13（鹽酸巴馬?。辄S連專屬峰；峰8、峰14（黃芩苷）、15～18為黃芩專屬峰。比較15批物質(zhì)基準(zhǔn)與其各單味藥共有峰峰面積的均值，見表3，其中峰3、5、6、12單味藥和物質(zhì)基準(zhǔn)的相對峰面積為黃連和黃柏2味藥峰面積和。結(jié)果表明各單味藥中共有峰與物質(zhì)基準(zhǔn)中對應(yīng)共有峰峰面積雖存在差異，但是各單味藥飲片主要物質(zhì)群均完整傳遞到物質(zhì)基準(zhǔn)。說明HJD物質(zhì)基準(zhǔn)制備工藝未造成飲片主要物質(zhì)群丟失?？梢奌JD物質(zhì)基準(zhǔn)主要成分從飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)形成較為完整的傳遞，且歸屬關(guān)系清晰[15]。

圖1 15批HJD物質(zhì)基準(zhǔn)的HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜(R)

表2 HJD物質(zhì)基準(zhǔn)的相似度評價(jià)結(jié)果

Table 2 Similarity evaluation results of HJD material benchmark

樣品相似度 S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15R S11.0000.9940.9990.9940.9950.9840.9920.9810.9940.9960.9960.9960.9980.9990.9910.998 S20.9941.0000.9940.9970.9970.9720.9860.9690.9830.9840.9850.9870.9910.9940.9760.992 S30.9990.9941.0000.9950.9950.9850.9940.9810.9930.9960.9950.9970.9980.9990.9920.999 S40.9940.9970.9951.0000.9990.9760.9900.9660.9800.9860.9860.9900.9890.9940.9780.992 S50.9950.9970.9950.9991.0000.9780.9920.9680.9820.9880.9880.9920.9890.9950.9800.994 S60.9840.9720.9850.9760.9781.0000.9950.9930.9810.9910.9900.9920.9860.9870.9890.991 S70.9920.9860.9940.9900.9920.9951.0000.9870.9830.9930.9920.9970.9900.9930.9890.996 S80.9810.9690.9810.9660.9680.9930.9871.0000.9840.9850.9880.9850.9850.9810.9850.987 S90.9940.9830.9930.980.9820.9810.9830.9841.0000.9950.9970.9910.9970.9930.9940.994 S100.9960.9840.9960.9860.9880.9910.9930.9850.9951.0000.9990.9990.9980.9970.9990.998 S110.9960.9850.9950.9860.9880.9900.9920.9880.9970.9991.0000.9980.9970.9960.9970.998 S120.9960.9870.9970.9900.9920.9920.9970.9850.9910.9990.9981.0000.9960.9980.9960.999 S130.9980.9910.9980.9890.9890.9860.9900.9850.9970.9980.9970.9961.0000.9980.9950.998 S140.9990.9940.9990.9940.9950.9870.9930.9810.9930.9970.9960.9980.9981.0000.9930.999 S150.9910.9760.9920.9780.9800.9890.9890.9850.9940.9990.9970.9960.9950.9931.0000.995 R0.9980.9920.9990.9920.9940.9910.9960.9870.9940.9980.9980.9990.9980.9990.9951.000

2.3 15批HJD物質(zhì)基準(zhǔn)出膏率及出膏轉(zhuǎn)移率考察

15批HJD物質(zhì)基準(zhǔn)凍干后記錄質(zhì)量，計(jì)算實(shí)際出膏率。取15批處方量的黃連、黃芩、黃柏、梔子飲片，按“2.1”項(xiàng)下方法分別制備15批HJD各單味飲片水煎液，凍干，記錄質(zhì)量。

實(shí)際出膏率＝/

為凍干后質(zhì)量，為各飲片取樣量

方中黃連為41.40 g，黃芩為27.60 g，黃柏為27.60 g，梔子為15.00 g，全方共111.60 g。全方的理論出膏率應(yīng)為各單味藥折算[16]，即理論出膏率＝0.37×對應(yīng)批次黃連飲片的出膏率＋0.25×對應(yīng)批次黃芩飲片的出膏率＋0.25×對應(yīng)批次黃柏飲片的出膏率＋0.13×對應(yīng)批次梔子飲片的出膏率。

圖2 各味藥材飲片及陰性與物質(zhì)基準(zhǔn)對照圖譜比較

表3 HJD物質(zhì)基準(zhǔn)與各藥飲片中特征峰峰面積比值

Table 3 HJD material benchmark and each pill characteristic absorption band area ratio

峰號(hào)峰面積相對峰面積 黃連黃芩黃柏梔子物質(zhì)基準(zhǔn)各單味藥材物質(zhì)基準(zhǔn) 1??250 994?61 8200.110.22 2???172 80042 3900.180.19 3237 518?88 833?60 9760.050.05 4???951 243219 7721.001.00 583 181?163 421?55 8030.040.05 680 486?628 574?111 3400.120.10 798 033???42 1520.270.04 8?43 420??44 9480.050.06 9951 202???283 6870.260.24 10539 067???156 8520.150.13 11512 156???165 5210.140.14 123 625 620?2 330 254?1 166 4191.001.00 13828 762???222 7810.230.19 14?941 975??695 4771.001.00 15?45 369??38 4540.050.06 16?34 205??26 0120.040.04 17?104 891??63 8400.110.09 18?202 736??116 6220.220.17

出膏轉(zhuǎn)移率＝實(shí)際出膏率/理論出膏率

結(jié)果見表4，計(jì)算得到15批HJD物質(zhì)基準(zhǔn)出膏率為15.32%～17.01%，平均出膏率為16.02%，各批次出膏率都處于均值的70%～130%，整體理論出膏率高于實(shí)際出膏率，平均出膏率轉(zhuǎn)移率為75.77%。

表4 HJD單味藥和物質(zhì)基準(zhǔn)出膏率及轉(zhuǎn)移率結(jié)果

Table 4 Results of benchmark paste yield rate and transfer rate of HJD

物質(zhì)基準(zhǔn)出膏率%轉(zhuǎn)移率/%物質(zhì)基準(zhǔn)出膏率%轉(zhuǎn)移率/% 黃連黃芩黃柏梔子理論實(shí)際黃連黃芩黃柏梔子理論實(shí)際 S129.4320.5716.687.7821.2116.2676.65S928.6018.7717.868.2820.8215.4874.37 S229.9619.4316.047.6620.9515.9476.09S1029.4019.8816.647.7621.0215.3272.88 S328.8521.0716.777.9521.1715.6874.07S1127.1520.5718.687.9820.9016.0576.81 S429.0520.5719.8210.3522.1917.0176.65S1229.9419.8518.087.5521.5415.6472.60 S530.1119.9316.278.1521.2516.2276.33S1328.5720.9417.116.9220.9815.9576.01 S628.5419.2117.949.7121.1115.8775.18S1427.9920.2116.887.5620.6116.2478.79 S726.4221.7516.518.1820.4015.7577.19S1528.8821.0316.427.8021.0616.1576.68 S830.4120.6617.208.9821.8916.6876.21

2.4 15批HJD物質(zhì)基準(zhǔn)中8種指標(biāo)成分含量測定及量值傳遞研究

2.4.1 色譜條件 同“2.2.3”項(xiàng)。

2.4.2 混合對照品溶液制備 同“2.2.1”項(xiàng)。

2.4.3 供試品溶液制備 同“2.2.2”項(xiàng)。

2.4.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液，按“2.2.3”色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。結(jié)果各成分分離度均＞1.5，符合《中國藥典》2020年版要求，峰形較好，理論塔板數(shù)（）以保留時(shí)間（R）和峰寬（）按＝16(R/)2計(jì)算均不低于15 000，樣品陰性溶液無干擾，色譜圖見圖3。

2.4.5 線性關(guān)系考察 精密吸取6個(gè)不同質(zhì)量濃度混合對照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（）、峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表5。

2.4.6 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、黃芩苷、梔子苷8種成分峰面積的RSD分別為0.33%、0.24%、0.65%、0.21%、0.49%、0.12%、0.36%、0.45%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1物質(zhì)基準(zhǔn)樣品按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液6份，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、黃芩苷、梔子苷8種指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.56、2.10、10.66、50.62、9.77、8.99、105.19、27.86 mg/g，RSD分別為1.47%、1.69%、1.31%、1.24%、1.02%、0.98%、1.42%、1.25%，表明該方法重復(fù)性良好。

A-混合對照品 B-HJD樣品 C-HJD樣品陰性 1-鹽酸黃柏堿 2-梔子苷 3-表小檗堿 4-鹽酸黃連堿 5-鹽酸藥根堿 6-鹽酸小檗堿 7-鹽酸巴馬汀 8-黃芩苷

2.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液，按“2.2.3”色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃柏堿、黃芩苷、梔子苷8種成分峰面積的RSD分別為1.39%、1.57%、1.21%、1.08%、1.17%、1.09%、1.88%、1.12%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表5 HJD中8種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程和范圍

Table 5 Standard curve, regression equation and range of eight components in HJD

指標(biāo)成分回歸方程r線性范圍/μg 鹽酸黃連堿y＝5 848 129.70 x＋12 029.550.999 30.01～0.34 表小檗堿y＝43 002 564.04 x＋19 482.450.999 70.02～0.76 鹽酸巴馬汀y＝7 282 531.21 x－19 606.560.999 30.02～0.11 鹽酸小檗堿y＝8 167 656.04 x－46 442.020.999 30.05～0.34 鹽酸藥根堿y＝5 499 245.55 x－2 005.650.999 60.02～0.39 鹽酸黃柏堿y＝2 403 258.82 x－11 317.460.999 40.02～0.62 黃芩苷y＝2 281 938.23 x－13 534.190.999 60.09～0.45 梔子苷y＝2 741 308.65 x－6 993.990.999 30.01～0.39

2.4.9 加樣回收率試驗(yàn) 取6份已測定的HJD物質(zhì)基準(zhǔn)樣品（編號(hào)S1）約0.15 g，精密稱定，分別加入50 mL混合對照品溶液（鹽酸黃連堿2.6 μg/mL、表小檗堿0.7 μg/mL、鹽酸巴馬汀3.2 μg/mL、鹽酸小檗堿15.3 μg/mL、鹽酸藥根堿3.0 μg/mL、鹽酸黃柏堿2.6 μg/mL、黃芩苷31.4 μg/mL、梔子苷8.2 μg/mL），按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃柏堿、黃芩苷、梔子苷的平均加樣回收率分別為97.80%、98.88%、97.92%、98.68%、99.75%、98.90%、99.46%、101.29%，RSD分別為1.17%、2.33%、1.23%、1.23%、1.87%、1.75%、2.43%、1.16%。

2.4.10 含量測定及量值傳遞關(guān)系研究 飲片中指標(biāo)成分含量按《中國藥典》2020年版一部測定。

飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)指標(biāo)轉(zhuǎn)移率＝/

表示物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)性成分的含量，表示飲片中指標(biāo)性成分的含量

15批HJD物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)性成分鹽酸黃連堿為0.61%～1.08%，平均轉(zhuǎn)移率為44.42%，表小檗堿為0.14%～0.24%，平均轉(zhuǎn)移率為16.22%，鹽酸巴馬汀為0.93%～1.52%，平均轉(zhuǎn)移率為69.54%，鹽酸小檗堿為4.09%～6.36%，平均轉(zhuǎn)移率為40.91%，鹽酸藥根堿為0.81%～1.07%，平均轉(zhuǎn)移率為47.58%，鹽酸黃柏堿為0.78%～1.06%，平均轉(zhuǎn)移率為80.88%；黃芩苷為7.45%～12.26%，平均轉(zhuǎn)移率為62.04%；梔子苷為0.42%～2.82%，平均轉(zhuǎn)移率為44.19%。根據(jù)相關(guān)規(guī)定，不同批次物質(zhì)基準(zhǔn)的指標(biāo)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)及轉(zhuǎn)移率應(yīng)控制在其均值的70%～130%[17]，結(jié)果見表6。15批HJD物質(zhì)基準(zhǔn)中除梔子苷外，其余化學(xué)成分的含量及轉(zhuǎn)移率均在均值的70%～130%，因此，從鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、黃芩苷、梔子苷的轉(zhuǎn)移率進(jìn)行分析，HJD物質(zhì)基準(zhǔn)的制備工藝穩(wěn)定，不同批次物質(zhì)基準(zhǔn)的鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、黃芩苷、梔子苷轉(zhuǎn)移率符合要求，說明實(shí)驗(yàn)前期黃連、黃芩、黃柏的質(zhì)量控制及物質(zhì)基準(zhǔn)制備工藝可以實(shí)現(xiàn)HJD中鹽酸黃連堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、黃芩苷、梔子苷含量的穩(wěn)定傳遞。HJD物質(zhì)基準(zhǔn)中梔子苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)未在其均值的70%～130%，可能不同批次指標(biāo)性成分含量差異較大為主要原因，另外也可能因梔子飲片質(zhì)脆，易碎，使取樣不均勻，導(dǎo)致含量差異大，這提示在今后進(jìn)行HJD物質(zhì)基準(zhǔn)制備時(shí)，考慮要制定飲片原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍，以確保物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量的穩(wěn)定。

3 討論

3.1 HJD物質(zhì)基準(zhǔn)制備工藝研究

前期實(shí)驗(yàn)研究已對煎煮器具、煎煮火候與時(shí)間控制、過濾用紗布目數(shù)等工藝條件進(jìn)行考察[18-19]，最終確定HJD制備工藝為黃連41.40 g，黃芩27.60 g，黃柏27.60 g，梔子15.00 g于陶瓷煎藥壺中，加水1200 mL，武火（2200 W）至沸騰，后文火（800 W）煎煮40 min，立即用2層200目紗布趁熱過濾，得藥液400 mL，凍干即得。在制備HJD物質(zhì)基準(zhǔn)程中，濾液放涼后，出現(xiàn)大量沉淀，精讀原文未找到沉淀的處理方式，咨詢有關(guān)專家建議沉淀不需要棄去，經(jīng)檢測沉淀中主要為鹽酸小檗堿和黃芩苷成分，故考慮避免藥效成分損失，濾過時(shí)需要趁熱。

3.2 供試品制備方法考察

考慮從化學(xué)成分提取的充分性和提取方法的方便性出發(fā)，前期實(shí)驗(yàn)對供試品溶液的制備進(jìn)行了不同提取方法（回流和超聲）、提取時(shí)間（20、30、50 min），提取溶劑（50%、70%、100%甲醇），料液比（1∶100、1∶200）條件比較，最后確定采用超聲提取30 min，甲醇為提取溶劑，料液比1∶200的效果最佳。

3.3 色譜條件優(yōu)化

前期采用DAD檢測器對HJD波長（345、277、238 nm）進(jìn)行優(yōu)選。確定238 nm波長下色譜峰較多，分離度和峰形較好。由于HJD物質(zhì)基準(zhǔn)中化學(xué)成分較多，故采用梯度洗脫，考察流動(dòng)相（甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸水溶液），結(jié)果采用甲醇-0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相的色譜圖中鹽酸小檗堿等生物堿類成分峰型不易拖尾，峰形較好，同時(shí)考察柱溫（30、35 ℃）和體積流量（0.6、0.8、1.0 mL/min）對色譜峰分離度的影響，結(jié)果柱溫35 ℃，體積流量0.6 mL/min色譜條件最佳。

表6 HJD物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)成分含量及轉(zhuǎn)移率結(jié)果

Table 6 Results of index composition content and transfer rate in material benchmark of HJD

樣品鹽酸黃柏堿/%轉(zhuǎn)移率/%梔子苷/%轉(zhuǎn)移率/%表小檗堿/%轉(zhuǎn)移率/%鹽酸黃連堿/%轉(zhuǎn)移率/% 飲片物質(zhì)基準(zhǔn)飲片物質(zhì)基準(zhǔn)飲片物質(zhì)基準(zhǔn)飲片物質(zhì)基準(zhǔn) S11.360.9066.185.422.7951.481.710.2112.281.820.8647.25 S21.101.0090.912.430.7330.041.280.2116.412.090.8038.28 S31.041.06101.922.050.5426.341.170.2420.512.131.0750.23 S41.120.9685.715.612.7448.841.160.1714.662.070.8340.10 S51.140.8675.445.722.8249.301.050.2220.951.770.9352.54 S60.980.7879.594.121.9948.300.970.1414.431.660.6136.75 S71.080.8679.634.552.0244.400.940.1819.152.060.7033.98 S81.160.8875.864.712.1946.501.730.2011.561.800.7943.89 S91.240.8064.524.902.1844.491.450.1812.411.660.6438.55 S100.961.00104.171.910.4221.991.200.2420.002.091.0851.67 S111.121.0089.294.952.1142.631.160.1512.932.080.9143.75 S121.060.9286.792.011.0652.741.010.2120.792.111.0549.76 S131.260.8869.843.872.0151.940.990.1616.161.920.8443.75 S141.100.8072.734.222.0348.100.980.1515.312.010.9245.77 S151.160.8270.693.551.9855.771.530.2415.691.980.9950.00 平均值1.130.9080.884.001.8444.191.220.1916.221.950.8744.42 范圍0.96～1.360.78～1.0664.52～104.171.91～5.720.42～2.8221.99～55.770.94～1.530.14～0.2411.56～20.951.66～2.130.61～1.0833.98～52.54 樣品鹽酸藥根堿/%轉(zhuǎn)移率/%鹽酸小檗堿/%轉(zhuǎn)移率/%鹽酸巴馬汀/%轉(zhuǎn)移率/%黃芩苷/%轉(zhuǎn)移率/% 飲片物質(zhì)基準(zhǔn)飲片物質(zhì)基準(zhǔn)飲片物質(zhì)基準(zhǔn)飲片物質(zhì)基準(zhǔn) S11.890.9851.8513.115.0638.601.601.0766.8815.2610.5268.94 S22.151.0247.4413.886.3645.821.721.3176.1616.8311.2366.73 S32.221.0748.2012.424.8038.652.611.5157.8516.439.3256.73 S42.080.8540.8713.404.1230.751.591.0767.3013.996.9549.68 S52.191.0347.0313.325.8944.221.581.1975.3216.0411.0769.01 S61.990.8341.7111.054.0937.011.561.0265.3814.887.4550.07 S71.650.9758.7911.215.6650.491.571.1371.9715.8910.4165.51 S82.160.8237.9613.664.6433.971.430.9365.0312.557.4759.52 S91.900.8946.8412.545.2141.551.450.9766.9013.128.3063.26 S102.131.0247.8911.216.0353.791.701.5289.4116.9112.2672.50 S112.111.0147.8712.554.8238.411.480.9966.8914.988.2154.81 S121.680.9858.3312.674.9639.152.381.4661.3415.559.9864.18 S131.881.0053.1913.084.9938.152.011.3667.6616.1111.0968.84 S142.030.9044.3311.325.4347.971.881.3370.7415.5610.3366.39 S151.960.8141.3312.984.5635.131.901.4174.2114.457.8754.46 平均值2.000.9547.5812.565.1140.911.761.2269.5415.249.5062.04 范圍1.65～2.220.81～1.0737.96～58.7911.05～13.884.09～6.3630.75～53.791.43～2.610.93～1.5257.85～89.4112.55～16.917.45～12.2649.68～72.50

3.4 物質(zhì)基準(zhǔn)的量值傳遞分析

中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)以出膏率、指紋圖譜及指標(biāo)性成分含量為指標(biāo)，全面考察飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)的相關(guān)性及關(guān)鍵質(zhì)量屬性的傳遞性。結(jié)果15批HJD物質(zhì)基準(zhǔn)出膏率、指標(biāo)性成分含量和特征圖譜可在飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)中穩(wěn)定傳遞。

15批物質(zhì)基準(zhǔn)中表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷含量較高，鹽酸藥根堿、鹽酸黃柏堿、梔子苷成分含量相對較低，各批樣品中各成分含量有所差異，可能與單味藥材飲片成分含量有關(guān)。梔子在方中用量較其他3味藥用量少，且因其飲片質(zhì)地脆，取樣時(shí)細(xì)粉較多，使批次間取樣不均勻，煎煮時(shí)成分溶出不均一，故可以考慮制備工藝前對梔子飲片統(tǒng)一處理，使化學(xué)成分穩(wěn)定傳遞。因此為了控制飲片的質(zhì)量波動(dòng)，減少批次間的質(zhì)量差異，除了控制飲片的含量限度范圍外，還可以通過對不同批次飲片混合后投料生產(chǎn)的方法[20]，以保證不同批次物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量相對穩(wěn)定。后期課題組還會(huì)對HJD制劑進(jìn)行深入研究，因此全面考察飲片–物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量屬性的量子傳遞，是保證HJD臨床療效的首要途徑，對HJD制劑研究具有重要意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis on quality value transmitting of material benchmark of Huanglian Jiedu Decoction

LI Jun-ge, ZHAO Ying, WANG Yong-chun, MENG Jia-tong, QIU Zhi-dong, TANG Qiu-zhu

Changchun University of Traditional Chinese Medicine, Changchun 130117, China

Clarify the key quality attributes of Huanglian Jiedu Decoction (HJD, 黃連解毒湯) material benchmark (MB), establish the fingerprint of HJD MB and determine the content of coptisine chloride, epiberberine, palmatine chloride, berberine, jatrorrhizine hydrochloride, phellodendrine chloride, baicalin, geniposide components and their transfer rate, and lay the foundation for the research of compound preparation of HJD in the later stage.Fifteen batches of material benchmarks were prepared according to the ancient technology, the paste rate was determined, the HPLC fingerprint of the material benchmark was established and the similarity evaluation was conducted, and the common peaks were determined. The content of eight components in the material benchmark was determined by the same method, and the transfer value of drinking slices to the material benchmark was analyzed.The average paste rate was 16.02%, with 18 common peaks, and the similarity to the control fingerprint was more than 0.9; The eight peaks were coptisine chloride, epiberberine, palmatine chloride, berberine, jatrorrhizine hydrochloride, phellodendrine chloride, baicalin, geniposide. The transfer rate of each index component from drinking sheet to material benchmark was coptisine chloride 0.61%—1.08%, epiberberine 0.14%—0.24%, palmatine chloride 0.93%—1.52%, berberine 4.09%—6.36%, jatrorrhizine hydrochloride 0.81%—1.07%, phellodendrine chloride 0.78%—1.06%, baicalin 7.45%—12.26%, and geniposide 0.42%—2.82%.By using the combination of ointment yield and multi-index composition content determination, this method is scientific and reasonable, and provides a scientific basis for the quality control of the material benchmark and the development of compound preparation.

Huanglian Jiedu Dcoction; material benchmark; fingerprint; coptisine chloride; epiberberine; palmatine chloride; berberine; jatrorrhizine hydrochloride; phellodendrine chloride; baicalin; geniposide; quality value transmitting

R283.6

A

0253 - 2670(2022)11 - 3348 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.010

2021-12-10

中醫(yī)藥事業(yè)傳承發(fā)展資金支持項(xiàng)目《重大疫情防治中藥方劑儲(chǔ)備庫建設(shè)項(xiàng)目》（吉中醫(yī)藥發(fā)[2021]11號(hào)）

李軍鴿，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，從事中藥制劑與新藥研究。Tel: (0431)86763972 E-mail: 407332695@qq.com

唐秋竹，學(xué)士，主任藥師，從事中藥制劑與中藥質(zhì)量控制研究。Tel: (0431)86763972 E-mail: 497903433@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]